整理自澳大利亚莫纳什大学（Monash University）Ramaciotti 电镜中心公开方案（protocols.io, DOI: 10.17504/protocols.io.kqdg39d97g25/v1）
体电子显微学（Volume Electron Microscopy，vEM）通过聚焦离子束连续切削与扫描电镜背散射电子（BSE）成像相结合，能够以纳米级 Z 轴分辨率获取生物组织的三维超微结构。由于 FIB-SEM 是在真空腔室内边切削边成像，样品必须在树脂包埋前完成充分的重金属整块染色（OTO 法）。本方案详细整理了基于 PELCO BioWave® Pro+ 系统的微波真空辅助制样操作流程，涵盖锇酸后固定、重金属块染、脱水、树脂渗透、包埋块修整及上机衔接的完整参数与操作说明，供电镜制样技术人员参考。
主要仪器与附件
• 微波组织处理系统：PELCO BioWave® Pro+（型号 36700），配备真空系统与 ColdSpot® 循环水冷控温系统；
• 切片修块设备：超薄切片机或修块机，配套玻璃刀或修块钻石刀；
• 表面镀膜设备：高分辨率离子溅射仪（用于金属导电膜沉积）；
• 成像系统：聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM），配备气体注入系统（GIS）及背散射电子（BSE）探测器。
核心化学试剂
• 重金属染色剂：四氧化锇（OsO4）、亚铁氰化钾（K4[Fe(CN)6]）、硫代卡巴肼（TCH）、乙酸双氧铀、Walton 氏天冬氨酸铅；
• 脱水溶剂：梯度乙醇系列（25%～100%）、无水丙酮；
• 包埋基质：高硬度环氧树脂配方（Hard Epon 配方）。
生物组织块单边尺寸建议修整至 1 mm³ 以内。样品首先经戊二醛/多聚甲醛（例如 2% PFA + 2.5% GA 的二甲胂酸钠或磷酸缓冲液）完成常规前固定，并使用缓冲液彻底清洗以去除残留游离醛基。
方案采用分步处理流程：
第一步：未还原 2% 四氧化锇渗透
加入 2% 四氧化锇溶液，置入 PELCO BioWave 中。程序设定为：开启真空（Vacuum on）、100 W 微波功率，执行 3 个循环（微波开 2 min / 关 2 min），单步运行 12 min。
第二步：1.5% 亚铁氰化钾原位还原
吸除上清液后加入 1.5% 亚铁氰化钾溶液，在相同条件下执行微波程序：开启真空、100 W 微波、3 个循环（开 2 min / 关 2 min），运行 12 min。
• 漂洗步骤：使用纯水漂洗 3 次，每次更换纯水后在微波中运行：关闭真空、150 W、40 秒。
为使重金属充分沉积于组织内部，依次执行以下多轮块染步骤：
• 1% TCH 孵育：40°C 环境下，开启真空、150 W 微波、3 个循环（开 2 min / 关 2 min），耗时 12 min；随后纯水微波漂洗（关真空，150 W，3 × 40 秒）。
• 第二轮 2% 四氧化锇染色：开启真空、150 W 微波、3 个循环（开 2 min / 关 2 min），耗时 12 min；随后纯水微波漂洗。
• 2% 乙酸双氧铀染色：室温加入染液后置于 4°C 冰箱孵育过夜；次日转入 BioWave，在 50°C 条件下执行强化程序：开启真空、150 W 微波、3 个循环（开 2 min / 关 2 min），耗时 12 min；随后纯水微波漂洗。
• Walton 氏天冬氨酸铅染色：加入预热的铅染液（pH 5.5），在 50°C 条件下执行微波程序：开启真空、150 W 微波、3 个循环（开 2 min / 关 2 min），耗时 12 min；随后纯水微波漂洗。
温控说明：开 2 分钟 / 关 2 分钟脉冲模式
BioWave 采用“开 2 min / 关 2 min”的间歇脉冲设置，配合腔室底部的 ColdSpot® 水循环控温盘，在微波关闭间隙及时导走累积热量，使样品腔温度严格稳定在预设值（室温、40°C 或 50°C），避免生物组织因过热发生超微结构变性。
梯度脱水（必须关闭真空）
样品依次经过梯度乙醇系列：25%、50%、75%、90%、100% 无水乙醇（2 次）及 100% 丙酮（2 次）。
操作注意：由于乙醇和丙酮沸点较低，负压抽真空会引起溶剂剧烈沸腾甚至破坏细胞结构，因此脱水全过程必须设定为：关闭真空（Vacuum off）、150 W 微波功率、每步照射 40 秒。
树脂渗透（开启真空）
配制高硬度环氧树脂（Hard Epon）。样品依次经过：25% 树脂、50% 树脂、75% 树脂（用丙酮稀释）以及 100% 纯树脂（3 次置换）。
运行参数设定：开启真空、250 W 微波功率、每步处理 3 分钟（6 步程序运行时间合计 18 分钟）。
*注：若实验安排跨天，可在第一次 100% 纯树脂微波处理后将样品留置过夜，次日再完成剩余两次纯树脂置换。
• 烘箱聚合：将样品转移至包埋模具中，注入新鲜纯树脂，置于 60°C 烘箱中聚合固化 48 小时；
• 修块与定位：使用超薄切片机配合修块刀去除周围多余空白树脂；切出半薄切片经甲苯胺蓝染色后，在光学显微镜下核对并锁定目标组织区域；
• 样品台安装：使用导电胶将包埋块牢固粘贴于平面样品台或 45° 预倾样品台上，并在样品块侧面均匀涂覆导电碳胶或银导电胶，建立良好的接地通路；
• 表面镀膜：在离子溅射仪中，于样品块表面沉积一层极薄金属导电膜；
• FIB-SEM 进室操作：装入电镜样品室，抽真空后通过气体注入系统（GIS）在目标切削面上沉积保护层（IBID），制作漂移校正标志，随后设定离子束切削厚度与电子束扫描参数，开启连续图像采集。
下表汇总了 PELCO BioWave® Pro+ 系统在各个制样阶段的标准设定参数，方便实验技术人员在仪器触控屏上进行程序编制：
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| 制样阶段 / 步骤 | 试剂与处理对象 | 功率与真空状态 | 控温条件 | 运行循环与时间 |
|---|---|---|---|---|
| 后固定与原位还原 | 2% 四氧化锇；1.5% 亚铁氰化钾 | 100 W，开启真空 | 室温（ColdSpot 水冷） | 各 3 循环（开 2 min/关 2 min），各 12 min |
| 中间漂洗步骤 | 双蒸水（每次换液） | 150 W，关闭真空 | 室温 | 3 次 × 40 秒置换 |
| TCH 桥联孵育 | 1% 硫代卡巴肼（TCH）溶液 | 150 W，开启真空 | 40°C 恒温 | 3 循环（开 2 min/关 2 min），12 min |
| 第二轮锇酸染色 | 2% 四氧化锇水溶液 | 150 W，开启真空 | 室温 | 3 循环（开 2 min/关 2 min），12 min |
| 铀染与铅染强化 | 2% 乙酸双氧铀；天冬氨酸铅（pH 5.5） | 150 W，开启真空 | 50°C 恒温（铀染先 4°C 过夜） | 各 3 循环（开 2 min/关 2 min），各 12 min |
| 梯度脱水阶段 | 25%～100% 乙醇系列；100% 丙酮 | 150 W，关闭真空 | 室温 | 7 步 × 40 秒连续置换 |
| 环氧树脂渗透 | 25%、50%、75% 及 100% 纯 Hard Epon | 250 W，开启真空 | 室温 | 6 步 × 3 分钟，共 18 min |
IMPORTANT NOTES
1. 样品尺寸与浸透均匀性
样品块单边尺寸应尽可能控制在 1 mm 以内。若处理难渗透的致密样品（如在溶剂中呈现漂浮状态），可依据原方案建议适当增加微波循环次数或延长渗透步骤。
2. 低沸点有机溶剂严禁抽真空
梯度乙醇及纯丙酮脱水阶段必须严格确认关闭真空（Vacuum off），避免因负压引发溶剂暴沸、样品飞溅及细胞结构破坏。
3. 剧毒化学试剂与安全防护
四氧化锇具有强挥发性与毒性，铀、铅化合物具有放射性及重金属毒性。所有试剂配制、液体更换及清洗操作必须在通过认证的化学通风橱内完成，严格佩戴防护装备，废液按危险废物专门收集处置。
方案出处与参考文献
1. Danne JC, Templin R, Gervinskas G, Korneev D, Gorelick S, Ramm G. Preparation of Tissue for Volume Electron Microscopy using Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM). protocols.io, 2024. DOI: 10.17504/protocols.io.kqdg39d97g25/v1.
*注：本方案整理自莫纳什大学电镜中心公开之实验操作指南，仅供电镜制样与生物超微结构研究人员参考与学术交流。
PELCO BioWave Pro+ 的核心技术在于精确控制的微波能量传递。与传统热传导方式不同，微波能量能够直接、快速、均匀地作用于组织样本内部，加速组织处理过程中的关键步骤。
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