CELL PROTOCOL
整理自澳大利亚莫纳什大学（Monash University）Ramaciotti 电镜中心公开方案（protocols.io, DOI: 10.17504/protocols.io.n92ldmeq7l5b/v1）
体电子显微学（Volume Electron Microscopy，vEM）可实现生物样品纳米级三维成像。其中，聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM）结合离子束逐层微米级切削与高分辨率背散射电子（BSE）成像，在 Z 轴方向具有极高分辨率。针对贴壁细胞与悬浮细胞样品，操作者必须在树脂包埋前完成整块高浓度重金属染色（OTO 法）。
本方案整理自莫纳什大学电镜中心公开的实验操作规程，详细记录了利用 PELCO BioWave® Pro+ 系统的微波与真空辅助功能完成细胞初级固定、低熔点琼脂糖预包埋、锇酸后固定、TCH 桥联、铀铅多重块染、梯度脱水、树脂渗透及修块上机的全部操作步骤与仪器设定参数。
主要仪器与配件
• 微波组织处理系统：PELCO BioWave® Pro+，配备真空室与 ColdSpot® 循环水冷温控系统；
• 切片与修块系统：超薄切片机，配玻璃刀、修块钻石刀；
• 表面导电喷镀仪：高真空溅射镀膜仪；
• 成像系统：聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM），配备气体注入系统（GIS）及背散射电子（BSE）探测器。
主要试剂与材料
• 初级固定液：Karnovsky 固定液（2% 多聚甲醛 + 2.5% 戊二醛，0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.4）；
• 细胞聚集载体：4% 超纯低熔点琼脂糖水溶液（融化温度 ≥ 90°C，凝固点 32.5～38°C）；
• 重金属染色试剂：四氧化锇（OsO4）、亚铁氰化钾（K4[Fe(CN)6]）、硫代卡巴肼（TCH）、乙酸双氧铀、Walton 氏天冬氨酸铅；
• 脱水剂：梯度乙醇（25%、50%、75%、90%、100%）、无水丙酮、3Å 分子筛；
• 包埋基质：高硬度 Hard Epon 环氧树脂配方。
细胞初级固定
• 贴壁细胞：去除培养基，加入 Karnovsky 固定液，室温固定 2 小时或置于 4°C 摇床过夜固定；
• 悬浮细胞：1200 rpm 离心 2 分钟，弃上清，加入 1 mL Karnovsky 固定液轻轻重悬，室温固定 2 小时或置于 4°C 过夜；
• 缓冲液清洗：固定完成后，使用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液清洗 3 次，每次 10 分钟。
琼脂糖预包埋（形成细胞微块）
由于单个细胞无法单独进行后续溶液置换与超薄切片修块，必须将分散细胞包裹固定在凝胶网络中：
配制 4% 超纯低熔点琼脂糖水溶液，水浴加热至完全融化。悬浮细胞或刮取的贴壁细胞经微量离心收集沉淀，小心吸除多余液体。
加入约 100 µL 预热的 4% 琼脂糖溶液，使用移液枪头轻柔重悬混匀，立即置于 4°C 冰箱凝固 10 分钟。
在解剖显微镜下，用手术刀片将固化后的琼脂糖细胞团切成单边尺寸小于等于 1 mm³ 的立方微块，转入多孔样品篮中继续后续步骤。
方案采取两步分立程序，避免预混产生的还原态锇大分子沉积阻碍深层渗透：
第一步：未还原 2% 四氧化锇渗透
将琼脂糖微块浸入 2% 四氧化锇（溶于 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液），放入 BioWave。参数：开启真空、100 W 微波功率，执行 3 个循环（微波开 2 min / 关 2 min），单步耗时 12 min。
第二步：1.5% 亚铁氰化钾原位还原
吸弃锇酸后加入 1.5% 亚铁氰化钾（溶于 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液），在相同程序下运行：开启真空、100 W 微波、3 个循环（开 2 min / 关 2 min），耗时 12 min。
• 漂洗步骤：使用纯水漂洗 3 次，每次在微波中运行：关闭真空、150 W、40 秒。
为使细胞膜与超微结构具备足够强的原子序数对比度及体相导电性，依次进行四步强化染色：
• 1% TCH 孵育：加入新配过滤的 1% 硫代卡巴肼（TCH 水溶液），在 40°C 下运行：开启真空、150 W 微波、3 个循环（开 2 min / 关 2 min），耗时 12 min；随后纯水微波清洗（关真空，150 W，3 × 40 秒）。
• 第二轮 2% 四氧化锇染色：加入 2% 四氧化锇纯水溶液，室温运行：开启真空、100 W 微波、3 个循环（开 2 min / 关 2 min），耗时 12 min；随后纯水微波清洗。
• 2% 乙酸双氧铀染色：加入滤过的 2% 乙酸双氧铀水溶液，置于 4°C 避光孵育过夜；次日在 50°C 条件下执行强化微波程序：开启真空、150 W 微波、3 个循环（开 2 min / 关 2 min），耗时 12 min；随后纯水微波清洗。
• Walton 氏天冬氨酸铅染色：加入预热的铅门冬氨酸染液（pH 5.5），在 50°C 条件下执行微波程序：开启真空、150 W 微波、3 个循环（开 2 min / 关 2 min），耗时 12 min；随后纯水微波彻底清洗。
脉冲控温防变性设置
细胞微块热敏感度高，微波程序全程采用“开 2 min / 关 2 min”脉冲循环，并在 ColdSpot® 循环冷却水槽支持下及时释放组织内部热量，确保样品温度严格受控，保护细胞内细胞器与膜骨架超微结构。
梯度脱水（关闭真空）
样品依次经过梯度脱水序列：25%、50%、75%、90%、100% 乙醇、100% 无水乙醇（加 3Å 分子筛）、100% 丙酮、100% 无水丙酮（加 3Å 分子筛）。
操作注意：由于乙醇与丙酮沸点较低，脱水阶段必须关闭真空，设定为 150 W 微波功率，每步处理 40 秒，避免有机溶剂剧烈挥发沸腾造成细胞破碎。
Hard Epon 环氧树脂梯度渗透（开启真空）
FIB-SEM 离子束连续切削要求样品块具有均匀的高机械硬度，配制 Hard Epon 配方。样品依次进入：25% 树脂（丙酮稀释）、50% 树脂、75% 树脂以及 100% 纯 Hard Epon 树脂（3 次更换置换）。
参数设定：开启真空、250 W 微波功率、每步处理 3 分钟（共 6 步，微波运行总时长 18 分钟）。
*注：若实验排程需跨天，可在第一次 100% 纯树脂微波处理后将样品留置室温或冷藏过夜，次日再执行后两次纯树脂置换。
• 烘箱固化：将浸透完成的微块放入专用扁平包埋模具，注入新鲜 Hard Epon 树脂，放入 60°C 烘箱中聚合固化 48 小时；
• 样品块截取与基底固定：使用精细珠宝锯或修块刀从包埋板中锯出含细胞沉淀的树脂块，用高硬度双组份环氧胶将其牢固粘贴在样品台上，60°C 固化过夜；
• 超薄切片修块与光镜定位：在超薄切片机（如 Leica UC7）上用玻璃刀修平树脂外周，修出微金字塔面；切取 500 nm 厚的半薄切片，经甲苯胺蓝染色在光学显微镜下复核细胞富集度与目标区域（ROI）；
• 导电连接与喷金：使用导电银胶或碳胶将样品侧面与样品台牢固连通接地，置于高真空溅射仪中沉积 20 nm 金属金导电层；
• FIB-SEM 进室成像：将样品载台装入 FIB-SEM 腔体，设定合适的工作距离，利用 GIS 气体注入系统在目标细胞表面沉积保护层（IBID），设置离子切削间距并开启序列图像自动采集。
下表汇总了莫纳什大学细胞制样方案中 PELCO BioWave® Pro+ 系统的各项核心程序设定：
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| 实验步骤 | 反应试剂与介质 | 功率与真空状态 | 温度条件 | 运行循环与时间 |
|---|---|---|---|---|
| 第一轮锇酸后固定 | 2% 四氧化锇（二甲胂酸钠缓冲液） | 100 W，开启真空 | 室温（ColdSpot 水冷） | 3 循环（开 2 min/关 2 min），12 min |
| 原位还原反应 | 1.5% 亚铁氰化钾（二甲胂酸钠缓冲液） | 100 W，开启真空 | 室温（ColdSpot 水冷） | 3 循环（开 2 min/关 2 min），12 min |
| 中间漂洗 | 超纯水（MilliQ 水） | 150 W，关闭真空 | 室温 | 3 步 × 40 秒连续置换 |
| TCH 桥联反应 | 1% 硫代卡巴肼（TCH 水溶液） | 150 W，开启真空 | 40°C 恒温 | 3 循环（开 2 min/关 2 min），12 min |
| 第二轮锇酸后固定 | 2% 四氧化锇水溶液 | 100 W，开启真空 | 室温 | 3 循环（开 2 min/关 2 min），12 min |
| 铀染与铅染强化 | 2% 乙酸双氧铀；天冬氨酸铅（pH 5.5） | 150 W，开启真空 | 50°C 恒温（铀染先 4°C 过夜） | 各 3 循环（开 2 min/关 2 min），各 12 min |
| 梯度脱水序列 | 25%～100% 乙醇系列；100% 丙酮 | 150 W，关闭真空 | 室温 | 8 步 × 40 秒连续置换 |
| Hard Epon 树脂渗透 | 25%、50%、75% 及 100% 纯 Hard Epon | 250 W，开启真空 | 室温 | 6 步 × 3 分钟，共 18 min |
1. 琼脂糖微块制备与细胞密度
琼脂糖混合时应轻柔吹打，避免产生气泡。微块单边尺寸应严格切至小于等于 1 mm³，以确保微波与试剂对深层细胞的均匀浸润。细胞沉淀需具备足够的细胞浓度，以便在后续超薄切片光镜定位时快速锁定细胞聚集区。
2. 有机溶剂必须关闭真空
在乙醇及丙酮梯度脱水阶段，必须确认关闭真空系统。负压环境会使低沸点挥发性溶剂暴沸，破坏琼脂糖骨架并损伤细胞膜完整性。
3. 剧毒与放射性试剂的安全规范
锇酸、乙酸双氧铀及天冬氨酸铅具有强毒性及潜在放射性。所有配液、换液及清洗必须在通风橱内严格执行，废液分类收集，操作全程佩戴防护手套。
方案出处与参考文献
1. Danne JC, Templin R, Gervinskas G, Korneev D, Gorelick S, Ramm G. Preparation of Cells for Volume Electron Microscopy using Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM). protocols.io, 2024. DOI: 10.17504/protocols.io.n92ldmeq7l5b/v1.
*注：本方案整理自莫纳什大学电镜中心公开之细胞实验操作指南，仅供电镜制样与细胞生物学研究人员学术交流与技术参考。
广州竞赢科学仪器有限公司作为 TED PELLA 在中国的官方授权总代理，我们致力于提供世界顶尖的电镜制样设备与专业支持。
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