整理自 protocols.io 公开方案（v1，2022 年 10 月 19 日发布，DOI: 10.17504/protocols.io.n92ldpz9nl5b/v1）；作者单位为澳大利亚莫纳什大学 Ramaciotti 冷冻电镜中心（Ramaciotti Centre for Cryo EM, Monash University）及德国欧洲分子生物学实验室（EMBL）电镜核心设施。本方案为参考操作流程，实际操作应同时遵守所在机构的实验室规范。
透射电子显微镜（TEM）可呈现光学显微镜无法分辨的细胞与组织超微结构：电子枪产生的高能电子束经电磁透镜聚焦，穿过塑料包埋样品的超薄切片，依据样品密度在荧光屏上成像并由数字相机记录。本方案整理了上述公开方案中组织样品的完整制备流程——固定、脱水、树脂渗透与聚合、超微切片，以及成像前的重金属反差染色；相关步骤同时给出使用微波组织处理系统加快处理的选项，并注明各步的微波功率、处理时间与真空设置。正文之外另行标注的补充提示，不属于原方案内容。
主要仪器与制样附件
• 微波组织处理系统：PELCO BioWave® Pro+;
• 取材工具：黑色 Teflon 板、牙蜡片、精细镊子（Dumont）、手术刀片与单刃刀片；5 mL 离心管、15 mL Falcon® 离心管、旋转管混合仪（Ratek）；
• 包埋与聚合：单头平底包埋模具（21 腔）、平底 BEEM® 胶囊（微波适用型）与 BEEM® 胶囊（OO 号）、恒温烘箱（Genlab）；
• 切片设备：体视显微镜（Olympus SZ30，配样品夹座）、超微切片机（Leica UC7）、双刃刀片；45° 玻璃刀及 6.4 mm 玻璃刀水槽；金刚石刀两把——Diatome Ultra Semi 35°、3 mm与 Diatome Ultra Wet 45°、3 mm（货号 UU45-30，超薄切片用）；半薄切片用 45° 玻璃刀或适用的金刚石刀，原方案未指定半薄切片的金刚石刀型号；Max Wax 热笔（展片去皱）；
• 切片辅助工具：装在木棒上的睫毛、或装在木棒上的达尔马提亚犬毛，载玻片，小型加热台，宽场光学显微镜（Olympus CHK2-F-GS），Perfect Loop 捞片环；
• 载网与染色附件：Gilder 铜网与镀钯铜网（50 目、200 目两种规格）；玻璃培养皿、载网储存盒、Parafilm 封口膜、玻璃板、注射器与 0.2 μm 孔径针头滤器（Acrodisc）、滤纸、铝箔；
• 成像系统：透射电子显微镜（JEOL JEM-1400 Plus，120 kV 机型）。
核心化学试剂体系
• 初固定液：Karnovsky 固定液，即 2% 多聚甲醛 + 2.5% 戊二醛，溶于 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（步骤规定 pH 7.2；原方案材料表另列有 pH 7.4 的 0.2 M 和 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液）；
• 后固定液：1% 四氧化锇（OsO4）+ 1.5% 亚铁氰化钾（potassium ferrocyanide，六氰合铁(II)酸钾三水合物），溶于 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液；
• 脱水试剂：梯度乙醇系列（30%、50%、70%、90%、95%、100%，以 MilliQ 水配制）、100% 无水乙醇、100% 丙酮、100% 无水丙酮；3 Å 分子筛（用于无水乙醇与无水丙酮储备液的使用前脱水，见第 3 节）；
• 包埋介质：Epon 环氧树脂；
• 染色试剂：甲苯胺蓝（半薄切片染色，原方案未给浓度）、醋酸铀、柠檬酸铅（材料表为三碱式柠檬酸铅三水合物）、10 M 氢氧化钠溶液。
全部固定与处理步骤须在通风橱内、佩戴适当的个人防护装备（PPE）进行；开始前须阅读每种化学品的MSDS。
在室温下，于 Teflon 板或牙蜡片上解剖目标组织：使用精细镊子与手术刀片操作，解剖全程使组织浸没在 Karnovsky 固定液（2% 多聚甲醛 + 2.5% 戊二醛，0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.2）中。组织块应不大于 1 mm³（边长 1 mm 的立方体），以保证固定液、溶剂与树脂能充分渗透。
将组织块放入盛有同一固定液的 5 mL 管、15 mL Falcon® 管或孔板中：4°C 固定过夜，或室温下在旋转混合仪上固定 2–4 小时。
初固定后，以 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液漂洗 3 次，每次 10 分钟，室温振荡，以去除残留固定液。原方案特别提醒：残留戊二醛可与锇反应、形成电子致密的伪影沉淀，因此进入锇酸后固定前必须充分漂洗。
以 1% 四氧化锇 + 1.5% 亚铁氰化钾（溶于 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液）后固定，室温振荡 2 小时；固定期间管盖或孔板盖须盖紧。原方案说明：亚铁氰化钾可还原锇，使后固定液变黑，被还原的锇也有助于减少伪影沉淀的形成；铁氰化钾可作为替代品与四氧化锇联用，其溶液呈澄清的琥珀色——替代品不是本方案的默认配方。
常规处理与微波处理参数比照：
• 常规台面条件：室温振荡2 小时；
• PELCO BioWave 微波处理参数：100 W，微波处理 120 秒 × 3 次，开启真空；每个处理间隔之间须加入 2 分钟暂停且不换液，以防样品过热。
• 阅读提示（非原方案新增条件）：原方案摘要将微波处理定位为加快处理的可选项，常规处理时间与微波处理参数是两种处理方式，二者择一，不应将常规处理时间与微波处理时间简单叠加。本提示同样适用于下文脱水与树脂渗透各步。
四氧化锇剧毒，须在通风橱内按 PPE 要求谨慎操作；用过的锇液按机构规范执处理。
后固定结束后，以 MilliQ 水漂洗 3 次，每次 10 分钟，室温振荡。漂洗后的样品可在 4°C 保存至多 1 周，再继续后续处理。
脱水与树脂渗透全程的通用判据：样品经乙醇、丙酮或树脂处理后若在液面上浮，则不要进入下一步——渗透充分的样品应下沉；若不下沉，可能需要延长渗透时间。Epon 树脂可冷冻保存，但使用前须回到室温。
脱水序列：30% 乙醇 → 50% 乙醇 → 70% 乙醇 → 90% 乙醇 → 95% 乙醇 → 100% 乙醇 → 100% 无水乙醇 → 100% 丙酮 → 100% 无水丙酮。其中在 70% 乙醇一步，如有需要可将样品置于 4°C 过夜。
脱水阶段处理参数：
• 常规台面耗时：每步 1 小时，室温振荡；
• PELCO BioWave 微波处理参数：每步 150 W、40 秒，不抽真空。
无水溶剂的准备：配制无水乙醇和无水丙酮时，可分别将 3 Å 分子筛加入对应的溶剂储备液，在使用前进行脱水；取用处理样品时，不将分子筛带入样品处理容器。此处理仅对应无水乙醇与无水丙酮两步，其他浓度的乙醇不经分子筛处理。
⚠️ 原方案提示：环氧丙烷可替代丙酮用于相应步骤，但其毒性极强，且可能脱水过度、损伤超微结构，采用前须充分权衡。
以无水丙酮与 Epon 树脂的混合液逐步渗透，配比与时间序列如下（各步均为室温振荡）：
• 可选步骤：无水丙酮 : Epon 树脂 = 3 : 1，渗透过夜；
• 无水丙酮 : Epon 树脂 = 1 : 1，渗透 6 小时；
• 无水丙酮 : Epon 树脂 = 1 : 3，渗透过夜；
• 100% Epon 树脂第 1 次置换，渗透 6 小时；
• 100% Epon 树脂第 2 次置换，渗透过夜。残留丙酮可能不利地影响树脂渗透与聚合，必要时应增加第 3 次 100% 树脂置换。
PELCO BioWave 树脂微波渗透参数：
上述每个渗透步骤均可改为微波处理：250 W，每步 3 分钟，开启真空，以此替代相应的台面渗透时长。
包埋与聚合：将样品转移至已标记的塑料包埋模具、平底 BEEM® 胶囊或标准尖头 BEEM® 胶囊中，胶囊/模具内盛 100% Epon 树脂；放入 60°C 烘箱聚合 24–48 小时。
修块：将树脂包埋块装入超微切片机样品夹，把样品夹固定到装有样品夹座的体视显微镜上，用双刃刀片手工将块的正面与四条边缘修成梯形。再将样品夹转移至 Leica UC7 超微切片机并固定，以 0.5 μm 进刀量手工修整块面，直至露出完整的组织切面；修整可用 45° 玻璃刀（厚 6.4 mm 或 8 mm），或适用的金刚石刀，如 Diatome 35° Ultra Semi 金刚石刀。
半薄切片与光镜定位：以 1 mm/s 速度切取 500 nm 半薄切片（45° 玻璃刀配经过滤水的水槽，或适用的金刚石刀）。用装在木棒上的睫毛、或装在木棒上的达尔马提亚犬毛捞取切片，使切片漂浮在载玻片上的一滴 MilliQ 水中，在小型加热台上干燥；随后在小型加热台上以甲苯胺蓝溶液染色 10–20 秒（甲苯胺蓝染核酸与蛋白质，可增强半薄切片的结构细节），以 MilliQ 水冲洗后在加热台上干燥。再以宽场光学显微镜观察：若感兴趣区域尚未切到，向深处继续修块并重复本步。
超薄切片：换装 Diatome 45° Ultra Wet 金刚石刀，以 1 mm/s 速度切取 90 nm、呈金色的超薄切片；用 Max Wax 热笔展片、去除皱褶。
捞片与干燥：用装在木棒上的睫毛或达尔马提亚犬毛，将切片捞取至 50–200 目铜网或钯包被铜网上；载网切片面朝上置于滤纸上，盖以玻璃培养皿，干燥 10 分钟，之后存入封闭的载网储存盒备用。
染色准备：在干净的台面或玻璃板上铺一张 Parafilm 封口膜，膜下垫少量水使膜保持平整，将染液与漂洗液分别滴在膜上进行液滴染色。转移载网时使用精细镊子或 Perfect Loop 捞片环，始终保持切片面朝下接触液滴；液滴用量约为：MilliQ 水 100–200 μL，醋酸铀与柠檬酸铅 50–100 μL。
• 醋酸铀染色：以 0.6% 醋酸铀 MilliQ 水溶液（过滤后使用）染色 3 分钟；醋酸铀与蛋白质、脂质作用以增强切片反差，其溶液须以铝箔包裹、避光存放，以防紫外光引起沉淀。染色后以 MilliQ 水漂洗 5 次，每次 1 分钟；
• 柠檬酸铅染色：以 0.1%–0.4% 柠檬酸铅 MilliQ 水溶液（过滤后使用）染色 3 分钟；使用前须向柠檬酸铅储备液中加入 4 滴 10 M 氢氧化钠溶液，以防柠檬酸铅接触二氧化碳后生成不溶的碳酸铅沉淀。柠檬酸铅与蛋白质、糖原作用，并与锇、醋酸铀结合以增强反差。染色后以 MilliQ 水漂洗 5 次，每次 1 分钟；
• 干燥与暂存：载网切片面朝上置于滤纸上，盖以玻璃培养皿，干燥 10 分钟，存入载网储存盒。
透射电镜成像：将载网装入透射电镜样品杆进行高分辨率成像。原方案示例：JEOL JEM-1400-Plus TEM，在 80 kV 下成像（原文记作 80 keV），配备高灵敏度底装 CMOS “Flash”相机。此为原方案的成像示例，并非对所有样品的统一参数要求。
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| 制样阶段 / 步骤 | 试剂配方与处理对象 | 常规台面条件（Benchtop） | BioWave 微波处理参数 | 真空与温控要求 |
|---|---|---|---|---|
| 初固定 | 2% 多聚甲醛 + 2.5% 戊二醛（0.1 M 二甲胂酸钠，pH 7.2）；组织不大于 1 mm³、浸没固定液中解剖 | 4°C 过夜，或室温旋转 2–4 h | 无微波设置 | — |
| 缓冲液漂洗 | 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（洗透以防残留戊二醛与锇成沉淀） | 3 次 × 10 min，室温振荡 | 无微波设置 | — |
| 锇酸后固定 | 1% OsO4 + 1.5% 亚铁氰化钾（铁氰化钾仅为备选） | 室温振荡 2 h，盖紧管盖 | 100 W，处理 120 s × 3 次，间隔暂停 2 min 不换液 | 开启真空 |
| 水洗与暂存 | MilliQ 水（此步在锇酸后固定之后） | 3 次 × 10 min，室温振荡；洗后样品 4°C 可存至多 1 周 | 无微波设置 | — |
| 梯度脱水 | 30%、50%、70%、90%、95%、100% 乙醇 → 100% 无水乙醇 → 100% 丙酮 → 100% 无水丙酮（每步独立；无水溶剂用 3 Å 分子筛预脱水） | 每步 1 h，室温振荡；70% 乙醇步可 4°C 过夜 | 每步 150 W、40 s | 不抽真空 |
| 树脂梯度渗透 | 无水丙酮 : Epon = 3:1（可选）、1:1、1:3、100% 树脂 ×2（必要时 ×3） | 依次为过夜（可选步）、6 h、过夜、6 h、过夜，室温振荡 | 每步 250 W、3 min | 开启真空 |
| 包埋与聚合 | 塑料包埋模具 / 平底 BEEM 胶囊 / 标准尖头 BEEM 胶囊 + 100% Epon | 60°C 烘箱聚合 24–48 h | 无微波设置 | 常压 60°C |
| 修块 | 双刃刀片修梯形；UC7 上以 0.5 μm 进刀修至完整组织切面（45° 玻璃刀或 35° Ultra Semi 金刚石刀） | 体视显微镜下手工修块后转 UC7 精修 | 无微波设置 | — |
| 半薄切片与光镜定位 | 45° 玻璃刀（过滤水水槽）或适用金刚石刀；甲苯胺蓝 | 500 nm、1 mm/s；热台染 10–20 s 后光镜看 ROI，未切到则向深处修块重复 | 无微波设置 | — |
| 超薄切片与捞片 | Diatome 45° Ultra Wet 金刚石刀；50–200 目铜网或镀钯铜网 | 90 nm 金色切片、1 mm/s；热笔展片，载网切片面朝上置于滤纸、覆培养皿干燥 10 min | 无微波设置 | — |
| 重金属反差染色 | Parafilm 上液滴染色，切片面朝下；0.6% 醋酸铀（过滤）、0.1%–0.4% 柠檬酸铅（过滤） | 铀染 3 min + 铅染 3 min，各以 MilliQ 水漂洗 5 次 × 1 min | 无微波设置 | 铅液用前向储备液加 4 滴 10 M NaOH 防碳酸铅沉淀 |
| 贯穿全程的判据 | 脱水与渗透各步（原方案第 6–19 步）后的样品沉浮 | 样品应下沉；上浮则延长渗透时间、不要进入下一步 | — | Epon 使用前须回至室温 |
1. 通用要求：通风橱、防护与安全数据表
全部固定与处理步骤须在通风橱内、佩戴适当的个人防护装备（PPE）进行；开始工作前须阅读每种化学品的MSDS。下列剧毒试剂须格外小心（原方案安全警告）：多聚甲醛与戊二醛有毒、有腐蚀性且可能致癌；二甲胂酸钠缓冲液含砷，急性毒性且可致癌；四氧化锇剧毒；亚铁氰化钾有急性毒性；醋酸铀有弱放射性，摄入、吸入或接触破损皮肤时剧毒。
2. 废锇液处置
以机构程序为准；柠檬酸铅、氢氧化钠等其他试剂的危害防护与废物分类同样按机构规范执行。
3. 微波处理时的真空设置（按原方案逐项执行）
真空开关不可一概而论，须按步骤分别设置：锇酸后固定与树脂渗透步骤开启真空（Vacuum on）；梯度脱水各步不抽真空（No vacuum）。锇酸后固定的每个处理间隔之间须有 2 分钟不换液的暂停，以防样品过热。
4. 柠檬酸铅染色的碳酸铅沉淀防范
柠檬酸铅接触空气中的二氧化碳会生成不溶的碳酸铅沉淀、污染切片。原方案的做法是在使用前向柠檬酸铅储备液中加入 4 滴 10 M 氢氧化钠溶液，而不是在染色皿周围放置氢氧化钠；染色过程中亦应尽量减少染液与空气的接触。
参考文献：
Danne JC, Crawford SA, Templin R, Clark J, Oorschot V, Ramm G. Preparation of tissue for transmission electron microscopy ultrastructural analysis. protocols.io, 2022. DOI: 10.17504/protocols.io.n92ldpz9nl5b/v1（作者单位：1. Ramaciotti Centre for Cryo EM, Monash University, Melbourne, Australia；2. Electron Microscopy Core Facility, EMBL, Heidelberg, Germany）
