主要仪器与制样附件

• 微波组织处理系统：PELCO BioWave® Pro+

• 细胞处理耗材：1.5 mL 微量离心管、15 mL Falcon® 离心管、孔板或培养皿、细胞刮、离心机、转移吸管；

• 琼脂糖包埋：沸水水浴锅或设定 95°C 的加热块、Teflon 板或牙蜡片、木棒、刀片；塑料包埋模具（RL064）、平底 BEEM® 胶囊（微波适用型，70021-PPT；另有 00 号 BEEM® 胶囊 RB001-500）与标准尖头 BEEM® 胶囊；恒温烘箱；

• 切片设备：体视显微镜、超微切片机、双刃刀片；45° 玻璃刀及 6.4 mm 玻璃刀水槽；金刚石刀两把——Diatome Ultra Semi 35°与 Diatome Ultra Wet 45°（超薄切片用）；Max Wax 热笔（展片去皱）；

• 切片辅助与染色附件：睫毛笔，载玻片，小型加热台，宽场光学显微镜，Perfect Loop 捞片环，Parafilm 封口膜，玻璃板，0.2 μm 孔径针头滤器，滤纸，铝箔；

• 载网与成像：50 目、200 目铜网与镀钯铜网，玻璃培养皿，载网储存盒；透射电子显微镜。

核心化学试剂体系

• 初固定液：Karnovsky 固定液，即 2% 多聚甲醛 + 2.5% 戊二醛，溶于 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）；另备 0.2 M 与 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）；

• 后固定液：1% 四氧化锇（OsO4）+ 1.5% 亚铁氰化钾（六氰合铁(II)酸钾三水合物），溶于 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液；

• 细胞聚集载体：超纯琼脂糖（UltraPure™ Agarose 1000），配制为 4% 水溶液；原方案标注的凝固温度约为 32.5–38°C，融化温度不低于 90°C；

• 脱水试剂：梯度乙醇系列（30%、50%、70%、90%、95%、100%，以 MilliQ 水配制）、100% 无水乙醇、100% 丙酮、100% 无水丙酮；3 Å 分子筛（用于无水溶剂储备液的使用前脱水）；

• 包埋与染色试剂：Epon 环氧树脂、甲苯胺蓝、醋酸铀、柠檬酸铅、10 M 氢氧化钠溶液。

全部固定与处理步骤须在通风橱内、佩戴适当的个人防护装备进行；开始操作前，应阅读各化学品的安全数据表。贴壁细胞在孔板或培养皿中必须全程浸没在溶液中，以防干燥。悬浮细胞专用说明：固定前，以及初固定、缓冲液漂洗、锇酸后固定和后固定后水洗的各步骤完成后，均以 1200 rpm 离心 2 分钟；去除上清后，用移液器轻柔重悬细胞沉淀。

• 贴壁细胞：去除培养基，轻缓加入 Karnovsky 固定液（2% 多聚甲醛 + 2.5% 戊二醛，0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.2），以 Parafilm 封口膜密封孔板或培养皿盖，室温固定 2 小时，或 4°C 过夜，期间振荡；

• 悬浮细胞：以移液器去除培养基，将细胞沉淀在 1 mL 同一固定液中轻柔重悬，固定条件同上。

漂洗：去除固定液，以 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液漂洗 3 次，每次 10 分钟，室温振荡。漂洗须充分：残留戊二醛可与锇形成电子致密的伪影沉淀，进入后固定前必须洗透。

以 1% 四氧化锇 + 1.5% 亚铁氰化钾（溶于 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液）后固定，室温振荡 1 小时；孔板、培养皿与离心管的盖须盖紧。

亚铁氰化钾可还原锇，使后固定液变黑；被还原的锇也有助于减少伪影沉淀的形成。铁氰化钾可作为替代品与四氧化锇联用，其溶液呈澄清的琥珀色。四氧化锇毒性极强，须在通风橱内按 PPE 要求操作；用过的锇须废弃于装有乙醇的带标签塑料容器中，以还原、中和锇。

漂洗与暂存：以 MilliQ 水漂洗 3 次，每次 10 分钟，室温振荡。漂洗后的样品可在 4°C 保存至多 1 周，再继续后续处理。贴壁细胞进入细胞刮取步骤（原方案步骤 5）；悬浮细胞跳过细胞刮取步骤，直接进入细胞收集与离心步骤（原方案步骤 6）。

• 收集：贴壁细胞以细胞刮从孔板或培养皿底轻轻刮下（步骤 5）；用 3 mL 或 1000 μL 转移吸管将细胞转入 1.5 mL 微量离心管，台式离心机 1200 rpm 离心 2 分钟成沉淀（步骤 6）；

• 融化：以盛沸水的水浴锅或设定 95°C 的加热块融化 4% 超纯琼脂糖水溶液（步骤 7）；

• 混匀：去除上清，向细胞沉淀加入约 100 μL（2 滴）预热的 4% 琼脂糖溶液（步骤 8），轻柔涡旋使沉淀均匀重悬（步骤 9）；可选：如需更浓缩的细胞沉淀，将离心管放回水浴锅或加热块至琼脂糖再液化，再以台式微量离心机离心沉淀细胞（步骤 10）；

• 凝固与取出：4°C 冷却 10 分钟使琼脂糖凝固（步骤 11）；以刀片切去微量离心管的极尖端（避开细胞），用木棒将样品推出（步骤 12）；

• 切块：将琼脂糖细胞块置于 Teflon 板或牙蜡片上，以手术刀或双刃刀片先对半切开，再切成条、进而切成不大于 1 mm³ 的立方块，用镊子小心放入 5 mL 管中（步骤 13）。

原方案为以下脱水与树脂渗透步骤分别列出了常规台面处理条件和 PELCO BioWave® Pro+ 微波参数；微波处理有助于试剂向组织和细胞内渗透，并可缩短处理时间。两种方式的处理时间与设备设置不同，应按具体步骤选择对应条件，不要将两种方式的时间简单叠加。各步的微波参数与台面时长并列如下。

梯度脱水（微波：40 秒，150 W，不抽真空；台面：室温振荡 1 小时；以下各步相同）：

• 30% 乙醇 → 50% 乙醇 → 70% 乙醇（在 70% 乙醇中，样品必要时可 4°C 过夜）→ 90% 乙醇 → 95% 乙醇 → 100% 乙醇 → 100% 无水乙醇 → 100% 丙酮 → 100% 无水丙酮，共 9 步；

• 无水乙醇、无水丙酮的储备液可加入 3 Å 分子筛，以在使用前脱水；环氧丙烷可替代丙酮（原方案步骤 21–25），但毒性极强，并可能使样品脱水过度、造成超微结构损伤。

树脂渗透（微波：3 分钟，250 W，抽真空；以下各步相同，台面时长逐条标注）：

• [可选] 100% 无水丙酮 : Epon 树脂（3 : 1），台面法室温振荡过夜；

• 100% 无水丙酮 : Epon 树脂（1 : 1），台面法 6 小时 → 100% 无水丙酮 : Epon 树脂（1 : 3），台面法过夜 → 100% Epon 树脂，台面法 6 小时 → 100% Epon 树脂，台面法过夜；

• 残留丙酮可影响树脂渗透与聚合，为此可再增加一次 100% 树脂渗透。Epon 树脂可存放在冰箱中，但使用前必须回到室温。

• 聚合（步骤 28）：将样品转入装有 100% Epon 树脂的已标注塑料包埋模具、平底 BEEM® 胶囊或标准尖头 BEEM® 胶囊，烘箱 60°C 聚合 24–48 小时；

• 初修块（步骤 29）：将包埋块装入超微切片机样品夹，样品夹固定于配有样品夹座的体视显微镜上，以双刃刀片手工将块的正面与四条边修成梯形；

• 精修（步骤 30）：样品夹与包埋块转入 Leica UC7 超微切片机固定；修整块面直至得到完整的细胞剖面。以 0.5 μm 进给手动修整，使用 45° 玻璃刀（厚度 6.4 mm 或 8 mm），或合适的金刚石刀，例如 Diatome 35° Ultra Semi 金刚石刀；

• 半薄切片与定位（步骤 31）：以 1 mm/s 切 500 nm 半薄切片（UC7，45° 玻璃刀配过滤水水槽，或合适的金刚石刀）；以睫毛笔捞取切片，漂浮在载玻片上的一滴 MilliQ 水中，在小型加热台上干燥；以甲苯胺蓝溶液在小型加热台上染 10–20 秒，MilliQ 水冲洗后在小型加热台上干燥（甲苯胺蓝染核酸与蛋白质，增强结构细节）；以宽场光学显微镜观察，未获得感兴趣区域则修得更深并重复本步；

• 超薄切片（步骤 32）：以 Diatome 45° Ultra Wet 金刚石刀、1 mm/s 切 90 nm 金色超薄切片；以 Max Wax 热笔展片以防皱褶；

• 捞片（步骤 33）：将切片回收到 50–200 目铜网或钯包被铜网上，切片面朝上置于滤纸上，盖以玻璃培养皿干燥 10 分钟，收入封闭的载网盒备用。

铺膜（步骤 34）：将一层 Parafilm 封口膜铺在洁净平整的工作台或玻璃板上，膜下滴少量水使其服帖。后续步骤以细镊子或 Perfect Loop 捞片环转移载网，切片面朝下在液滴间移动；液滴用量：MilliQ 水约 100–200 μL，醋酸铀与柠檬酸铅约 50–100 μL。

• 醋酸铀染色（步骤 35）：0.6% 醋酸铀（MilliQ 水配制，过滤）染 3 分钟；溶液须裹以铝箔、避光保存，以防紫外光照引起沉淀；随后 MilliQ 水冲洗 5 次 × 1 分钟（步骤 36）；

• 柠檬酸铅染色（步骤 37）：0.1%–0.4% 柠檬酸铅（MilliQ 水配制，过滤）染 3 分钟；随后 MilliQ 水冲洗 5 次 × 1 分钟（步骤 38）；

• 干燥与收存（步骤 39）：载网切片面朝上置于滤纸上，盖以玻璃培养皿，干燥 10 分钟，收入载网储存盒；

• 成像（步骤 40）：将载网装入电子显微镜。

化学品安全与废弃物处置

• 以下化学品必须在通风橱内佩戴适当的个人防护装备（PPE）极其小心地操作：多聚甲醛与戊二醛有毒、腐蚀性强、潜在致癌；

• 二甲胂酸盐缓冲液含砷，具急性毒性且致癌；

• 四氧化锇毒性极强；用过的锇须废弃于装有乙醇的带标签塑料容器中，以还原、中和锇；

• 亚铁氰化钾具急性毒性；

• 醋酸铀具微弱放射性，摄入、吸入或接触破损皮肤时毒性极强。废液与废弃物处置均须同时符合所在机构的危化品与辐射安全管理规定。

操作要点速记

• 悬浮细胞的离心节奏：固定前，以及初固定、缓冲液漂洗、锇酸后固定和后固定后水洗的各步骤完成后，1200 rpm 离心 2 分钟，换液时以移液器轻柔重悬沉淀；贴壁细胞在孔板或培养皿中处理时，应始终浸没于相应处理液中，避免样品表面干燥；

• 暂存节点：后固定后的 MilliQ 水漂洗完成后，样品可在 4°C 保存至多 1 周；70% 乙醇脱水步骤中，必要时也可 4°C 过夜。

PELCO BioWave® Pro+ 微波组织处理系统由Ted Pella, Inc.推出；PELCO BioWave® Pro+ 微波处理系统可用于原方案所列的部分制样步骤，通过微波辅助处理缩短相应的试剂处理时间；各步骤的微波功率、处理时间及真空设置应以具体操作参数为准。

竞赢科学是TED PELLA 公司在中国的总代理，可提供实验方案支持。如需了解电镜制样设备，请关注竞赢科学或联系技术团队。