本文摘译自 Avrahami 等发表于 ACS Applied Materials & Interfaces 的研究（2026，18(42)：57081–57090），仅摘取其中全金电镜载网的制备过程与结果讨论两部分，文献来源见文末。
制备过程
该全金电镜载网的制备工艺包含两次光刻、蒸发与电镀两种金属沉积以及湿法刻蚀，先在晶圆上定义带孔薄箔，再电镀构建结构栅条，最后将成品载网从牺牲晶圆上释放。
带孔箔的制备
- 晶圆：熔融石英晶圆。
- 光掩模：铬掩模由直写激光光刻（Heidelberg MLA-150）制作；掩模 1A 为圆形 2 μm 孔，掩模 1B 为椭圆形 2 μm × 6 μm 孔。
- 光刻胶：正性光刻胶以图像反转模式使用（AZ5214），5000 rpm 旋涂 60 s，110 °C 软烘 1.5 min；在接触式掩模对准机（KARL SUSS MA-6）中透过掩模曝光；120 °C 曝光后烘烤 60 s，随后泛光曝光 10 s 并显影，形成适合剥离的倒梯形胶剖面。
- 金属化：蒸发（Evatec BAK-501A）30 nm 钛黏附/牺牲层，再蒸发 50 nm 金种子层。
- 剥离：在 N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中过夜溶解光刻胶，丙酮冲洗去除剥离的金属碎片。
栅条的定义
栅条与载网外周用厚正性光刻胶定义：AZ4562 以 1250 rpm 旋涂 60 s，110 °C 烘烤 7 min；在掩模对准机中多次曝光以改善脱气，再于 90 °C 曝光后烘烤 2 min。曝光与硬烘之间留足时间，有利于光刻胶中的氮气逸出、改善胶质量。胶层须足够厚以支撑目标电镀金厚度，轮廓仪确认胶高约 12.5 μm，高于目标电镀厚度。增厚胶层的替代方案包括双层涂覆，或使用更厚且与电镀兼容的光刻胶。
电镀
以导电的金薄箔为种子层，在光刻胶定义的沟槽内沉积厚金层；图案化晶圆为阴极，铂电极为阳极。电解液为市售亚硫酸金/硫代硫酸金电解液（MetGold ECF 33B），参数取厂家推荐的最优范围：电流密度 4 mA/cm²，温度 54 °C，标称沉积速率约 0.25 μm/min。
载网释放
先在 NMP 中去除光刻胶，再在 49% 氢氟酸（HF）中溶解熔融石英与钛层。HF 剧毒且强腐蚀，所有操作均按机构安全规程、使用兼容防护装备、在通风橱内进行并备有葡萄糖酸钙凝胶。载网之间的薄箔连接在释放时自发断裂，单个载网留在溶液中。作者自制了带底部孔的聚四氟乙烯支架，可将整片晶圆浸入 HF、同时留住释放的载网并便于水洗。需要注意，剥离产生的残余金碎片可能污染 HF 槽液。释放后的载网可存于水中，或干燥后存入载网盒。
载网分选与存放
干燥时排水产生的毛细作用会使载网聚集，逐片取出放到滤纸上干燥费时。作者自制了利用径向对称在干燥时分离载网的 3D 打印分选装置，其多孔底座的孔小到能留住载网、又能让水排走；并设计了可放入 15 或 50 mL 离心管、容纳 4–12 片载网的载网盒，用于载网功能化与存放。
结果与讨论
全金电镜载网的晶圆级制备
该一体化晶圆级工艺用标准微加工方法制备全金电镜载网，流程为：
- 在熔融石英 4 英寸晶圆上，用剥离工艺先定义钛/金多孔箔；
- 第二次光刻在厚光刻胶中定义栅条与外周，再电镀金构建结构网架；
- 用氢氟酸去除熔融石英与钛牺牲层，释放出 594 片独立的全金载网。
单个制备周期约需 4 天，多片晶圆并行处理可放大通量。由于箔孔几何由光刻定义、并经剥离转移到金属层，只需更换光掩模即可改变箔孔几何，其余流程不变；下文的椭圆孔支持载网即利用了这一设计灵活性。
用电镀模拟调控栅条厚度与倾转通达性
为调控电镀工艺，作者建立了金沉积数值框架，模拟电流密度、沉积速率与种子层孔在电镀中被填充时金生长随时间演变之间的关系。实际操作中，已用电镀时间并不能可靠预测最终厚度，因为沉积过程中可能间歇性失去电接触；因此模拟用于定义预期厚度窗口、解释与几何相关的沉积趋势，最终栅条厚度则由触针轮廓仪实测设定与验证。
轮廓仪测得结构栅条厚度为 6.5–8 μm，包围了模型与法拉第解析估算在标称沉积速率 0.25 μm/min 下预测的理想值 7.5 μm。这一厚度窗口在机械稳定性与高倾角下的电子透明性之间取得平衡：7–8 μm 的栅条大约允许 73° 的倾转通达，与冷冻电子断层成像（cryo-ET）倾转系列采集兼容。2 μm 箔孔对整体沉积轨迹只有微弱扰动，而模型捕捉到了 6–8 μm 孔时中心与边缘之间更大的厚度差，为按箔孔几何预测与调控金厚度提供了定量框架。
各向异性箔几何提供内在的接触引导线索
该工艺的灵活性使作者能制备含椭圆孔的各向异性箔几何，直接在载网表面提供内在接触引导线索。椭圆孔与圆孔载网用同一晶圆级工艺制备，网架结构、箔材料、箔厚度、细胞培养条件、染色方案与图像分析流程均相同，设定的箔孔几何是唯一有意改变的设计变量。与化学微图案化不同，各向异性载网仅凭基底几何就定向了肌动蛋白组织：在椭圆孔载网上培养的细胞，其丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）优先沿椭圆孔长轴对齐；而在传统圆孔载网上培养的细胞，肌动蛋白组织明显更接近各向同性。
定量上，作者用 ImageJ 的 Directionality 插件测得的局部 F-肌动蛋白取向计算对齐指数（AI），每幅图像的 AI 先在同一载网内平均，得到一个载网级数值，再比较 4 片椭圆孔载网与 4 片圆孔载网的载网级均值。结果在所有角度窗口尺寸下，椭圆孔载网的平均 AI 都高于圆孔载网，且两组完全秩分离——每一片椭圆孔载网的平均 AI 都高于每一片圆孔载网，两条件无重叠（Cliff’s δ = 1.0；Welch t 检验 p < 0.005；每条件 n = 4 片载网）。两次独立实验方向一致。对合并的角度取向分布分析亦支持此结论：椭圆孔载网偏离各向同性的幅度约为圆孔载网的 7.2 倍。
表 1 椭圆孔与圆孔载网的载网级肌动蛋白对齐指数
| 半窗口 h（°） | 椭圆孔 AI（均值 ± SD） | 圆孔 AI（均值 ± SD） | Welch p | Cliff’s δ |
|---|---|---|---|---|
| 10 | 0.1755 ± 0.0138 | 0.1206 ± 0.0055 | 0.0019 | 1.00 |
| 20 | 0.3328 ± 0.0234 | 0.2387 ± 0.0110 | 0.0015 | 1.00 |
| 30 | 0.4662 ± 0.0285 | 0.3533 ± 0.0150 | 0.0013 | 1.00 |
注：数值为跨载网的均值 ± SD（每条件 n = 4 片载网，取自 2 次独立实验）；Welch t 检验与 Cliff’s δ 按每片载网的均值计算。Cliff’s δ = 1.0 表示完全秩分离；该完全分离排序对应的 Mann–Whitney 精确 p 值为 0.029。
作者据此认为，电镜支持物的几何本身即可影响细胞组织。各向异性箔结构因此提供了一种简单的物理策略来引导 F-肌动蛋白对齐，且该策略集成在载网制备中、无需另加处理步骤，载网本身由此从被动支持物变为可主动调控的生物界面。
与冷冻电镜及细胞样品制备流程的兼容性
在单颗粒分析方面，作者用所制全金载网对脱铁铁蛋白做单颗粒重构：在 200 kV Glacios 冷冻透射电镜（赛默飞）上，按金标准傅里叶壳层相关（FSC = 0.143）判据，得到全局分辨率 2.15 Å 的重构；该重构来自 971 张显微照片中选出的 221,390 个最终颗粒。用聚乙二醇硫醇（PEG-SH）作表面处理可定性改善载网润湿性，使水性液滴比在未修饰载网上更容易穿过箔孔。
面向 cryo-ET，生物相容的全金结构、适合观察较大细胞区域的 2 μm 孔、以及为高倾角通达优化的栅条厚度（约 73°）共同满足玻璃化细胞倾转系列采集的主要几何要求。作者在所制载网上完成了蛋白质微图案化与细胞 cryo-ET：微图案化生成边界清晰的黏附图案，控制细胞在载网上的形状与位置；在椭圆孔载网上培养的内皮细胞经冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）减薄后，在 300 kV Krios 冷冻透射电镜（赛默飞）上采集了倾转系列，重构的断层图能分辨精细细胞特征，包括线粒体嵴上与 ATP 合酶二聚体一致的蛋白质复合物。
该工艺用剥离定义箔几何、用钛作牺牲层，可用单一刻蚀液释放载网并保持最终支持物为全金。这一路线的局限是最小可达孔径受光掩模分辨率约束：本实现中掩模由直写激光光刻（Heidelberg MLA-150）制作，特征尺寸下限约 1 μm，晶圆曝光则用接触式光刻（KARL SUSS MA-6）。亚微米孔对减小单颗粒分析中的束诱导运动有利，但较大的箔孔很适合 cryo-ET，后者常需要在较大的细胞区域上采集倾转系列。
作者还讨论了后续优化方向：增大六边形开口以便对更大区域做 cryo-FIB 减薄、并可能扩大可达倾角范围，但须与机械稳定性权衡，开口越大可能需要更宽和/或更厚的栅条；直接铣削栅条虽可行，却可能把金颗粒再沉积到薄片上。一种折中方案是加厚外缘、同时在中央区用间距更大的栅条，这需要增加第三块掩模、一次光刻与第二次电镀，使外缘与中央支持结构以不同厚度制备。此外，用 MLA-150 等无掩模对准机替代实体掩模与掩模对准机，可免去每次改版制作新掩模、降低成本并加快原型迭代；但其数字微镜器件投影的像素化会影响接近系统分辨率的特征，改用与像素网格对齐的方形、矩形或其他多边形可能提高图案保真度。第二步光刻定义的 3.05 mm 圆形载网外周尺寸大得多，对像素化不敏感，因此无掩模光刻对两步图案化都可能是可行的替代方案。
自行制备的成本考量
对有学术洁净室可用条件的实验室，自行制备可大幅降低金载网成本。每片 4 英寸晶圆可制备 594 片载网，按 90% 可用载网产率计，每片晶圆约产出 535 片可用载网。按晶圆、洁净室、金电镀与金属蒸发成本估算，可用载网的经常性直接成本约为每片 1.69 美元，而作者找到的最接近的全金商业同类产品当前标价约为每片 44 美元。但制备需要相应的微加工设施与受训人员，实验室可培训一名研究生执行该工艺，或聘用受训的洁净室工程师，其人员与培训成本是上述直接制备成本之外的额外考量。因此，自行制备的经济收益取决于实验室对微加工设施、受训人员的可得性以及对载网的需求量。
文献来源
- Avrahami, A., Ben Asher, N., Zalk, R., Logvina, N., & Engel, L. (2026). Gold Electron Microscopy Grids with Anisotropic Foil Geometry Enable On-Grid Contact Guidance. ACS Applied Materials & Interfaces, 18(42), 57081–57090. DOI:
10.1021/acsami.6c12639（DOI 入口）
