原文：Corroyer-Dulmont, S., Masson, C., & Quemin, E. R. J. (2026). Towards Integrative and Multi-Scale Imaging with Recent Advances in Cryo-Electron Tomography. International Journal of Molecular Sciences, 27(21), 9519. DOI: 10.3390/ijms27219519（DOI 入口）
摘要
冷冻电子断层成像（cryo-ET）能够在接近天然的状态下，三维观察复杂生物环境中的分子结构。近年来，样品制备、仪器、数据采集与计算处理方面的重大进展显著拓展了 cryo-ET 的适用范围。曾经通量很低、主要限于少数薄样品与少数应用场景的工作流程，如今可用于从分离的大分子组装体到细胞、类器官乃至组织等多种样品。与此同时，(i) 用于样品减薄的冷冻聚焦离子束铣削自动化流程与更流畅的倾转系列采集，(ii) 高压冷冻样品处理方法的改进（包括提取转移），(iii) 日益整合的重构与处理管线，都在共同提高这项技术的通量、可重复性与可及性。新兴的深度学习工具进一步为靶标识别、带反馈回路的质量控制、断层图重构以及以子断层平均为代表的下游分析提供便利。本文讨论 cryo-ET 工作流程各方面的近期进展——这些进展正与多模态成像相结合、逐步弥合分子尺度与细胞尺度；同时指出当前的局限，以及可能进一步拓展 cryo-ET 能力的新兴技术，特别是在与互补方法结合、迈向整合结构细胞生物学的方向上。
1 引言
在生物学所用的成像技术中，电子显微镜（EM）是分辨能力最高的技术之一。无论常温电镜（常规电镜）还是低温下的冷冻电镜（cryo-EM），其分辨能力都取决于所用电子发射源，因为它直接关联电子束的性质，如波长与加速电压。历史上，Ernst Ruska 因发明透射电子显微镜（TEM）获 1986 年诺贝尔物理学奖；约 30 年后，Jacques Dubochet、Joachim Frank 与 Richard Henderson 因发展冷冻电镜“以高分辨率测定溶液中生物分子的结构”获 2017 年诺贝尔化学奖。在硬件方面，冷冻电镜从早年戏称的“团块学”（blob-ology）时代走到今天，得益于像差校正电镜稳定性的提高、高质量场发射电子枪，以及直接电子探测器的出现——后者与能量过滤器配合，可在低剂量成像条件下提高信噪比。如今，功能强大的软件实现也不断发展，支持在现代电镜上高通量采集数据、并以最少的人工干预高效完成后续处理。
冷冻电镜依赖玻璃化冷冻，可用于多种样品：样品经冷冻固定形成玻璃态无定形冰后，处于冷冻含水状态。在不染色、不化学固定、不脱水的情况下，样品结构接近天然状态，其密度直接对应蛋白质、脂质、核酸等生物内容物。传统做法是把悬浮的生物分子薄层涂布在支持载网上，再投入液态乙烷或冷却至液氮温度的乙烷/丙烷混合物中速冻（投入式冷冻）。“分辨率革命”之后，冷冻电镜的主要模式现包括小晶体的微晶电子衍射、分离大分子的单颗粒分析（SPA），以及多形性或独一无二对象的断层成像。近期应用涵盖大型蛋白质复合物、柔性结构域与膜蛋白，用于研究构象异质性、组成状态与结构—功能关系。样品制备仍然复杂、具体流程须逐案定制，但其最终目标是通过提高生物复杂性与完整性，弥合细胞生物学与分子生物学之间的分辨率鸿沟，迈向整合结构生物学。
本文讨论该领域近期的进展如何为冷冻电子断层成像（cryo-ET）带来多尺度连续谱——cryo-ET 传统上用于三维观察细胞或独一无二、多形性的对象。文章主要聚焦样品制备的各个方面，也涉及数据采集与处理的一些特点，以及如何使 cryo-ET 适用于从大分子组装体到多细胞生物的广泛样品；同时触及正在进行与未来的工作，这些工作有望突破当前关联方法的关键技术挑战，从而推进结构细胞生物学的前沿，使人们能在原位直接理解动态生物过程，并与互补技术有力整合。
2 正文
电子断层成像（ET）的基本原理是：在 TEM 中对给定的感兴趣区域（ROI）采集一系列二维投影图像——典型倾角范围 −60° 至 +60°、步进 2–3°——再在计算机中重构出三维体积。倾转系列的排布取决于所用采集方案（连续式、双向式或剂量对称式），它与所用放大倍数、像元尺寸决定的视场和分辨率一道，共同影响数据质量。
2.1 cryo-ET 的样品制备
2.1.1 玻璃化切片或冷冻薄片上的细胞 cryo-ET
ET 最初用于树脂包埋样品的超薄切片（厚度通常小于 100 nm）：样品经化学固定、脱水并以重金属染色。cryo-ET 的最初尝试对象包括细胞提取物或纯化的细胞器、原核细胞、多形性病毒颗粒，以及扁平或压扁的真核细胞（厚度 <1 μm）。cryo-ET 主要用于这类模型，特别是稀有、多形、异质、不适合 SPA 的对象；但单独使用时，其观察也限于细胞周边区域（图 1）。尽管制样方法的持续改进正通过基于裂解液或细胞开启的方法把 SPA 拓展到生理相关状态的原位分析，要再现细胞环境的全部复杂性，往往仍需要多个系统的整合。
能成像的样品尺寸受电子束的平均自由程限制。为此，人们提出在低温条件下用超薄切片机切片的方法，称为玻璃化切片冷冻电镜（CEMOVIS）。但在实践中，诸多技术难点使 CEMOVIS 成为要求极高的制样步骤，并带来若干缺陷，如切片难以有效附着到载网上、压缩伪影等，因而限制了其广泛采用。
CEMOVIS 已被成功用于 cryo-ET，至今仍被视为一种替代方案；而如今更常用的是用聚焦离子束（FIB）铣削制备冷冻薄片。冷冻 FIB 铣削利用 FIB 的特性避免机械切片引入的机械应力，制得电子透明的截面，即薄片（厚度通常为 150–300 nm）。该技术最初为材料科学开发、使用双束扫描电镜（SEM）系统，后被改造用于生物样品。
冷冻 FIB 铣削的一般做法是：先把细胞沉积（如细菌、酵母细胞）或直接培养（如哺乳动物细胞）到支持载网上，再经投入式冷冻玻璃化（图 1(3.b)）。载网可涂覆并以聚赖氨酸或纤连蛋白功能化以帮助贴壁细胞接种，更精细的定位则包括用光微图案化使细胞附着在预定位置。冷冻薄片是样品的一层薄截面，铣削后它依托周围冰包埋生物材料的本体、像是悬挂在载网上自我支撑（图 1(4.a)）。早期一些流程只在样品顶部消融材料，得到“楔形薄片”；但由于难以获得成像所需的均匀精确厚度、且载网底部的冰污染难以去除，后来更倾向于从两侧铣削。这种铣削几何至今仍用于标准流程，并配合气体注入系统（GIS）喷镀保护，以防过铣、减小窗帘效应（curtaining）、避免样品在铣削或成像时荷电。事实上，最后一步也常做溅射镀膜以提高薄片表面导电性，所沉积的铂金属层足够薄，不影响后续 cryo-ET 数据采集。其他改进也是活跃的研究方向，包括防止冰污染、整个流程的自动化、多步铣削图案，以及减小薄片机械张力的应力释放“微膨胀节”等。
除常用的镓离子源 FIB 外，近年还出现了由氮、氙、氧或氩产生的等离子体 FIB。它们铣削速率更高，在某些情况下因离子源性质不同而铣削损伤更小，还可使用更低的电压。目前已有多个厂家的多种系统配置在售，硬件与功能各异。
图 1 从样品制备到生物学洞见的冷冻电子断层成像工作流程。按样品类型给出不同的玻璃化方法（1–3）。对薄样品，包括分离颗粒（<500 nm）、细胞裂解液与分离细胞（<10 μm），投入式冷冻通常最合适（3.b）；该方法需要高浓度颗粒，吸印时可能给细胞造成应力，且同一实验的玻璃化质量可能不均一，只能由冷冻 FIB、SEM 或 TEM 评估。已有工作致力于使该过程自动化、减少样品用量，并提出喷射冷冻等其他玻璃化方法（3.a）。厚样品（>10 μm），如真核细胞单层、类器官或组织样品，需要高压冷冻（3.c）。其中 waffle 法（2.“Waffle”—4.b）是一种专门的玻璃化方法，用高压冷冻仪处理细胞或组织（详见正文）。玻璃化后，样品可经 FIB 铣削（4.a、b）或提取转移制备（4.c），再在 TEM 上采集倾转系列（5）。初步数据处理包括倾转系列对齐、衬度传递函数（CTF）校正与三维体积重构，生成断层图（6.“断层图重构”）；后续分析包括分割（6.“分割”）与子断层平均（6.“子断层平均”），经渲染后实现细胞结构的可视化、亚细胞组织的直接观察，以及大分子在原位的中高分辨率结构测定（7）。图以 BioRender 制作（Masson, C. (2026)），并经许可改编自 Klumpe 等 2021（4.a“传统薄片”）、Kelley 等 2022（4.b waffle 薄片）、Schiøtz 等 2024（4.c 提取转移）、Nguyen 等 2024（细胞结构）、Shimakawa 等 2024（亚细胞组织）与 Zimmermann 等 2023（大分子）。
2.1.2 类器官或组织样品 cryo-ET 流程的进展
除少数贴壁细胞系单层与悬浮的小细菌或酵母（即厚度小于 10 μm）外，投入式冷冻不足以使厚度可达约 250 μm 的样品充分玻璃化，这类样品需要改用高压冷冻（HPF）（图 1(3.c)）。类器官、组织或植物等较厚样品本就难以玻璃化，除非使用冷冻保护剂，而冷冻保护剂可能造成伪影甚至渗透冲击。对非常大的样品，可在 HPF 前先用标准振动切片机切片——样品可包埋在软琼脂中，也可不包埋。HPF 传统上在小型铝载具中进行，但这类装置与后续 TEM 中的 cryo-ET 数据采集不兼容，多年来已有若干解决方案。
第一种方案是改造载具，使其兼容 FIB 铣削与后续 cryo-ET 成像。该方法因在载具上铣削而样品稳定性高，理论上可尽量减少转移中的直接接触；但当前设计需要使用专门设计的支架作冷冻超薄切片，且要得到 TEM 可观察的薄片须去除大量样品材料，单个载具的通量因此严重受限。
第二种方案是把传统电镜载网放进 HPF 载具内，冷冻后可直接使用。该方法最初以线虫为对象演示：载网置于装有 2-甲基戊烷的 HPF 载具中（图 1(2)）。2-甲基戊烷的升华温度低（−160 °C），高于水的反玻璃化温度（−140 °C），因此载网上的样品很容易从载具上脱离，可直接对其表面作冷冻 FIB 铣削。但 2-甲基戊烷在冷冻前短暂孵育期的潜在副作用尚不清楚，且其在室温快速挥发可能导致载具填充不完全、在冷冻时造成压力伪影；此外铣削时须去除大量冰包埋生物材料，迄今限制了薄片产量（如用 Ga⁺ FIB 每个位点最长约 30 h）。另一种是“waffle 法”（图 1(2–4.b)）：把样品沉积在载网背面，再把载网夹在两个平载具之间作 HPF，其样品体积受载网方格尺寸限制；通过使用不同类型的载网，该方法可容纳细胞悬液、类器官与小块组织作 cryo-ET。但与把细胞培养或沉积在载网上的传统冷冻 FIB 铣削相比，它仍要去除大量材料，薄片制备通量因此降低，也可能限制 cryo-ET 采集时的倾角范围。
最后，对 HPF 后的大体积样品作 cryo-ET 的另一方案是“冷冻 FIB 提取转移”（cryo-FIB-lift-out，图 1(4.c)）：用微操纵器与夹钳把样品的一部分从载具转移到接收电镜载网上。该方法源于材料科学，后被改造用于室温树脂包埋的生物样品，也用于低温条件。自近十年前证明其可行性以来，样品块转移、与接收端的附着等许多方面都在取得显著进展，还有许多创新功能可提高通量，包括从单个样品块可获得的薄片数量。
目前典型的提取转移流程是：先在 ROI 周围粗铣出一个样品块（有时也称粗薄片），再把样品块表面连接起来——连接可通过 FIB 铣削时的材料再沉积实现，也可用 GIS 冷沉积铂。连接对象可以是装在微操纵器针上的适配件（如由接收载网制成的铜或金金属件），也可以直接连到针尖。连接牢固后，用 FIB 铣削把样品块与样品其余部分分离，再转移到接收载网。此外，还可以从样品块上用 FIB 依次制备约 2–4 μm 厚的切片，即所谓“连续提取转移”或序列化流程；这些切片可附着在接收载网的栅条上，也可附着在网孔区。
简言之，第一种附着方式即附着到栅条，稳定性更高，尤其是用 FIB 再沉积作双位点附着时；但它把样品块与切片的尺寸限制在网孔的尺寸与几何之内。附着到网孔区则在样品尺寸与放置位置上更灵活，但切片的分离与附着依赖静电作用，有时不足以固定，会导致切片丢失、产出较小。附着完成后，切片可用与细胞铣削类似的流程与软件自动精修成薄片。尽管近期有所改进，冷冻 FIB 提取转移在技术上仍具挑战性、通量低，且更关键的是绝大多数步骤缺乏自动化。
无论用哪种方法，组织 cryo-ET 除本身是活跃研究领域外还面临若干挑战。前述困难之一是要去除大量材料才能得到 TEM 可成像的薄薄片，组织样品的铣削时间长，薄片通量因而低于细胞样品。低温等离子体 FIB 铣削的新发展为此提供了缓解方案：铣削消融速率提高后，用氙离子束为以 waffle 法制备的样品制薄片，每位点的时间可降至约 50 min。等离子体 FIB 似乎还能限制铣削损伤深度：镓离子时为 60 nm，氙离子时降至 30 nm（薄片两侧表面均受影响）。这种损伤还可通过低电压进一步减小，如用 8 kV 代替镓离子的 30 kV；但低电压铣削会使探针尺寸增大，要缓解随之而来的窗帘效应对薄片的影响，需要开发新的铣削方案，或对电镜作针对生物应用的实际改造。
cryo-ET 的另一挑战是在成像时难以把 ROI 与样品其余部分区分开，在组织样品中这一问题按比例放大。这不仅使冷冻 FIB 铣削时难以瞄准 ROI，也使在没有互补或正交方法验证、解释所观察表型的情况下，cryo-ET 数据集中 ROI 的识别不可靠。还需注意，薄片制备过程中样品的绝大部分体积都被 cryo-FIB 铣削消融而丢失；综合这些固有特点，薄片只代表拥挤且大得多的细胞体积中高度动态的分子事件的一个微小快照。
2.2 协同更好：cryo-ET 与关联及整合框架
2.2.1 关联光电显微术（CLEM）
多年来，cryo-ET 已与光学显微镜（LM）等许多技术结合，形成广泛使用的关联管线，关联可在室温进行，也可在玻璃化后的低温条件下进行。实践中，cryo-ET 与 LM 的长处与短处恰好互补（图 2a、b(i)）。例如，LM 可弥补 cryo-ET 单独使用时时间分辨率低、ROI 难以识别的不足。LM 可在上述整个 cryo-ET 流程的不同阶段发挥作用：(i) 玻璃化前，室温 LM 可对感兴趣的事件或表型作时间分析；(ii) 玻璃化后，冷冻光镜可帮助在 FIB-SEM 中定位 ROI，既可在冷冻 FIB 铣削前、也可在铣削后进行。
在 xy 平面内瞄准 ROI 相对直接，但 z 方向的关联分辨率较低。为此已有几种准确瞄准薄片铣削 ROI 的用例。最直接的方案是使用 FIB-SEM 腔内集成的荧光光学显微镜（iFLM），在薄片制备前或制备中监测荧光信号。尽管自动化功能正在实现中，但由于多数市售 FIB-SEM 中 iFLM 的物镜并未处在与电子束、离子束的符合点上，不同成像模式之间的切换与配准目前主要靠手动完成。在具有特定硬件配置的电镜上，近期进展已实现铣削过程中或薄片制备间歇的实时荧光监测；但仍有一个问题：最终精修后，小颗粒的大部分荧光信号变得不可检出，在精修前的光镜观察与精修后由 cryo-ET 分析的最终薄片之间形成断档。
与此同时，可用荧光微球作关联标记——它们用 iFLM、电子束或离子束在 FIB-SEM 中都易于识别。理论上这可在自动铣削前精确定位薄片；但铣削中载网与样品因形变或漂移而移动，会导致错位与薄片定位不准。此外，这要求荧光微球均匀分布且靠近 ROI，与组织、类器官等大样品不兼容。
沿这一方向，基于分子标签识别靶标的方法持续演进，现已有许多针对 cryo-ET 流程的策略，包括金等金属纳米颗粒、金属螯合蛋白、以及基于核酸或蛋白质组装体的纳米结构（图 2a、b(iv)）。这些都是有前景的发展方向，近期已有长篇综述，本文不再详述。
图 2 冷冻电子断层成像中用作互补或整合工作流程的冷冻关联方法。（a）与 cryo-ET 结合使用的四种主要方法概览：关联光电显微术（CLEM）、软 X 射线断层成像（SXT）、质谱成像（MSI）与基于标签的方法。（b）对每种方法，以表格给出代表性技术、主要优势与可实现的目标定位。（i）CLEM 将荧光显微术与 cryo-ET 整合，引导目标识别与薄片制备；（ii）SXT 弥合光镜与电镜之间的分辨率鸿沟；（iii）MSI 提供详细的分子信息，可与 cryo-ET 获得的结构数据关联；（iv）多种基于标签的方法可促进特定蛋白质及其在细胞表面或细胞内部形成的大分子复合物的定位。每种方法均给出代表性与开创性文献：Li 等 2023、Groen 等 2025、Schwarz 等 2025、Silvester 等 2021、Fung 等 2023、Young 等 2026、Luo 等 2026。图以 BioRender 制作（Masson, C. (2026)），SXT 面板经许可改编自 Groen 等 2025。
2.2.2 用全细胞体积成像弥合光镜与 cryo-ET 之间的鸿沟
冷冻 CLEM 是在生物样品中瞄准 ROI 最常用的方法，但它受两种成像模式之间分辨率鸿沟的限制：光镜分辨能力较低，加上在样品中定位荧光信号的空间准确度差，限制了铣削前或铣削中的瞄准。为克服这一点，已实施另外两种方法：用于体积成像的冷冻连续切片，以及冷冻软 X 射线断层成像（cryo-SXT）。
将冷冻连续切片体积成像与 cryo-ET 结合。 冷冻连续切片（又称“切片-观察”，slice and view）是一种体积电镜方法，可提供样品的大空间背景下各向同性的三维表示及其超微结构。实际做法是用 FIB 逐层消融样品表面材料，再用 SEM 以二次电子或背散射电子（配合相应探测器）成像，如此分步、重复地进行。
这类体积电镜方法已广泛用于室温下化学固定、树脂包埋的样品，但其在冷冻样品上的应用仍较有限，原因包括荷电效应、窗帘伪影等若干缺陷。尽管 GIS 的应用可减小表面形貌起伏，窗帘效应仍是高质量成像的重要障碍，主要源于冰污染、裂缝或细胞异质性造成的样品表面不均一。电子束损伤、冰污染、电镜不稳定、采集时间长、图像衬度低等问题进一步增加了冷冻条件下体积电镜的难度。不过，冷冻“切片-观察”FIB-SEM 可为 ROI 周围环境提供背景信息、辅助目标定位，例如用于实际提取转移位点旁边的区域。薄片制备也可由 SEM 成像引导：逐步铣削顶面直至 ROI 可见，再铣削底面达到适合 cryo-ET 的厚度。许多方面都已有进展报道，包括新型离子束源的实现、扫描策略优化与自动化。
将 cryo-SXT 与 cryo-ET 结合。 cryo-SXT 基于低能 X 射线对冷冻含水样品成像，通常可对整个完整的哺乳动物细胞作纳米尺度的三维成像，无需事先化学固定、染色或切片。这得益于在“水窗”能量范围内成像：在该范围内，氧与含碳结构以不同速率吸收光子，从而为生物样品尤其是生物样品提供天然的固有衬度。在这一能量范围内，软 X 射线可穿透最深约 10 μm，可对大多数类型的细胞作整体成像。尽管 cryo-SXT 的空间分辨率低于 TEM（各向同性分辨率约 30 nm），它已成为一种有力的工具：相比光镜，它能以更高的横向与轴向分辨率可视化三维细胞体积，且辐射损伤影响很小。因此，它也已与其他成像模式结合，包括冷冻关联光与 X 射线显微术（cryo-CLXM），以及涉及冷冻电镜/断层成像的多尺度实验（cryo-CXEM），相关研究已有不少报道（图 2a、b(ii)）。
在 cryo-CXEM 框架下，cryo-SXT 可与 cryo-ET、cryo-FIB-SEM、冷冻提取转移等技术结合，提供一种整体工作流程——多种成像技术之间准确关联、跨越不同长度尺度，在亚细胞与分子层面探测细胞与大分子。事实上，最新的整合工作流程已把冷冻光镜、cryo-SXT、冷冻 FIB 铣削与 cryo-ET 直接结合在同一样品上，在天然条件下对复杂样品与小样品（纳米颗粒）以及稀有细胞事件作全面的多模态成像研究。过去这只限于全球少数大型同步辐射设施，而带等离子体源的“台式”紧凑软 X 射线装置的发展，很可能在未来几十年使更多实验室能够使用这一技术，并拓展其在结构细胞生物学与医学生物学等领域的研究应用。
2.2.3 迈向原位结构细胞生物学的整合方法
CLEM、基于标签的方法以及从 cryo-ET 数据直接推断等方法虽能实现细胞识别，但往往耗时或繁琐；而且它们以全面、系统的方式报告样品化学身份或分子异质性的能力有限，其空间尺度也常不足以支撑 cryo-ET 分析。新兴的结构与可视蛋白质组学领域依赖一组部分基于质谱（MS）的技术，从蛋白质（蛋白质组）、蛋白质网络（相互作用组）或脂质（脂质组）的角度表征细胞状态与组成。
MS 与 cryo-EM/ET 即使并行开展也能提供高度互补的样品信息，将两者结合有力推动了整合结构生物学。现有众多 MS 技术无需标记，覆盖生物分子的代谢、结构与功能研究。蛋白质、脂质、核酸及其形成的生物分子组装体，既可 (i) 在分离状态、批量状态或直接在生物系统中研究，也可 (ii) 在多种变性条件（如肽段碎裂、加入化学交联剂）下或以天然质谱研究。因此，基于 MS 的技术不仅极大贡献于生物化学领域，也贡献于我们当前对细胞、分子与结构生物学的理解。cryo-ET 管线与生物分子 MS 的良好关联，近期已在交联质谱的整合数据处理中得到例证，特别是应用于单个肺炎支原体以及更大的哺乳动物精子细胞时。
质谱成像（MSI）是另一种成熟方法，可在完整样品中以低至中等分辨率研究生物分子的化学识别与定位，因而特别能与 cryo-ET 的结构成像互补（图 2a、b(iii)）。在 MSI 方法中，基质辅助激光解吸/电离（MALDI）MSI 无偏倚且功能强大，可识别组织切片、单个细胞乃至亚细胞层面大量小代谢物、脂质与蛋白质的空间分布，生成聚焦于细胞异质性与代谢状态的高度详细的分子图谱。近期有研究把 cryo-ET 与 MALDI-MSI 应用于同一样品，旨在 TEM 数据采集后直接评估载网上的细胞身份。简言之，这一创新工作包含一条标准 cryo-ET 管线（从细胞在电镜支持载网上生长到 cryo-ET 数据采集与处理），随后作冷冻干燥、MSI 采集与专门的数据分析。尽管技术上具挑战性，这种组合方法可推断细胞间异质性、检出混合群体中的不同物种或多种细胞类型，甚至提供亚细胞组织的洞见；值得注意的是，已有专门的软件环境来整合该管线的全部模态。最新发表的工作还描述了用冷冻 FIB-SEM 进行的二次离子质谱（SIMS）化学成像，它与冷冻光镜兼容，并已与细菌的冷冻电镜分析以及真核细胞薄片的 cryo-ET 数据采集结合。这些都是与已建立的 cryo-CLEM 流程整合的概念验证实验。尽管潜力明确——特别是它们无需遗传改造、无需外源探针或任何其他可能显著扰动细胞的操作——这些方法目前仍相当小众、通量低，因为它们需要专门仪器。
对序贯研究而言，包含 cryo-ET 制样与数据采集之后由 MS 直接识别与表征样品的复杂管线，其产出仍然惊人，并有望在不久的将来获得更广泛的应用。尽管 MALDI-MSI 结果可观，但与处于亚微米分辨率区间的 SIMS 数据相比，它的空间分辨率似乎相当有限（像元尺寸 5 μm）；而 SIMS 通常针对小分子或无机分子，脂质、蛋白质等生物分子检不出。因此，重大挑战仍然存在，正在进行的研究成果将有助于开发更易用、自动化的基于 MS 的方法，使其能与 cryo-ET 标准流程顺利兼容，从而在原位、多尺度分析动态生物系统的相互作用。
2.3 cryo-ET 数据采集与处理
2.3.1 采集方案
在 cryo-ET 实践中，冷冻含水样品在 TEM 镜筒内被物理倾转（图 1(5)），在每个预定倾角对给定 ROI 生成一系列二维投影图像；随后这些倾转系列在计算上对齐成堆栈，并重构为以近天然状态表示样品体积的三维断层图。
视样品台几何而定，倾转系列的单幅图像通常在 −60° 至 +60° 的角度范围内以 2° 或 3° 的增量采集。实践中，样品台机械结构把倾转限制在 ±70°，且高倾角时样品厚度增加，会因多次电子散射进一步限制信噪比。总体而言，这类倾转方案导致三维信息的采样不均匀，即傅里叶空间中信息的“缺失楔”，并在实空间造成形变伪影；因此断层图呈各向异性分辨率，物体在 z 方向被拉长，垂直于倾转轴的特征信息丢失。
此外，低温下观察的冷冻含水样品对电子束高度敏感，必须用低剂量设置成像，而每次采集都会累加样品所受的电子剂量。于是，系列后期采集的图像是在电子束辐射损伤累积之后取得的，除高分辨率信息减少外，还会导致样品畸变、弯曲或漂移，以及噪声与伪影升高。
经典倾转方案包括单向或双向数据采集，角度增量可有不同取法（如线性间隔、可变间隔或与余弦成比例）。而如今 cryo-ET 的常见实践更多依赖 2010 年代引入的剂量对称采集。在单向（连续）倾转方案中，采集从最高倾角之一开始、沿一个方向连续进行，特别用于树脂包埋样品（其在照明下的树脂收缩在对齐时较易处理）。在双向倾转方案中，采集从 0° 开始，两个倾转分支作为独立片段依次向正、负高角度采集；该方案曾特别适合自动化数据采集，但存在“跳跃启动”问题，因为累积辐射损伤在两个分支间分布不均。在剂量对称倾转方案中，采集从 0° 开始，在正、负分支间对称、并行地进行（如 0°、−3°、+3°、−6°、+6°……直至 ±60°）；该方案在剂量逐步累积的同时保留最低倾角处的高分辨率信息，有利于堆栈对齐与子断层平均（STA）的处理。
相位板是置于 TEM 镜筒内物镜后焦面的一个小装置，用于对电子作相位调制。它因能提高衬度、进而帮助下游数据处理，再次受到关注，正在拓展冷冻电镜与 cryo-ET 的能力。尽管实际限制阻碍了其广泛应用，新型设计与原型机的改进仍在不断报道。生物样品是由轻元素组成的弱相位物体，在 TEM 下固有衬度很低；为缓解这一点，Volta 相位板在包括 cryo-ET 研究在内的许多用例中表现尤为有力。
最后，双轴倾转方案近来也受到关注：借助旋转样品杆，载网可作 90° 样品台倾转。其目标是在同传统单轴断层成像正交的两个不同轴上，对给定 ROI 采集额外数据，从而增加三维采样信息量、最小化缺失楔效应。鉴于冷冻条件下的样品对辐射损伤高度敏感，有限的低剂量预算须在同一点要采集的两个倾转系列之间分配，这会影响断层图重构与下游处理。值得注意的是，双轴 cryo-ET 与相位板的衬度增强相结合，为病毒颗粒的结构及其与细胞骨架细胞组分的相互作用（特别是埃博拉病毒）带来了新的洞见。
2.3.2 实现自动、快速、可靠数据采集的软件
TEM 自动化数据采集已有多种软件实现，其中一些有针对 cryo-ET 的专门配置：EM-Tomo（TVIPS 公司）、Leginon、SerialEM、TOM、Tomography（赛默飞）与 UCSF Tomography。
其中，SerialEM 是主要的学术软件包之一，已被 cryo-ET 社群广泛使用。它免费、开源，提供灵活多用的平台，用户可完全控制电镜设置以执行定制采集管线，代价是学习曲线较陡——须熟悉其界面、众多控制面板与各种功能。
与 SPA 或微晶电子衍射等其他冷冻电镜成像模式相比，cryo-ET 仍相对缓慢，且后续用 STA 作高分辨率结构测定也具挑战（图 1(6)）。ROI 一旦识别（通常靠人工目视，但更自动化的瞄准方法正在取得进展），传统的倾转系列采集协议要求为所选每个目标的倾转系列采集，在其紧邻处、沿倾转轴方向各设一个独立的跟踪位置。即使每个倾角的跟踪与聚焦可在同一点完成，适合 cryo-ET 的位点数量仍不仅受其在载网上（随机）分布的限制，还受高质量成像本身的效率限制（取决于样品台几何、电镜光学与探测器配置）。cryo-ET 的创新采集策略正走向并行乃至连续方案，以提高速度与产出。
除以预校准或实时监测方式应用的位移预测校正模型方法外，快速“连续”数据采集的概念仍处于起步阶段。另一种高通量策略是基于电子束图像位移（BIS）的多点采集（multishot），已有 BISECT（用 BIS 加速电子冷冻断层成像）与在轴多点采集方案提出。值得注意的是，最新的并行采集实现 PACE-tomo 与 SPACE-tomo 以 SerialEM 界面脚本形式提供，已被许多实验室与核心设施迅速采用。其他近期工作开发了在电子束图像位移期间连续记录（CR-BIS）的方法，以优化相机时间分配，从而同时加速 cryo-ET 与 SPA 的数据采集。这些新实施的管线不仅为在高端电镜上也快速采集、以提升当前 cryo-ET 能力而定制，还与 STA 的高分辨率高级处理兼容。
因此，更适合冷冻 FIB 铣削制备的薄片的策略也在稳步发展。这类薄片常含有密集的、高度感兴趣的生物信息，但局限于有限的面积内。倾转系列通常以足够的目标间距采集，以避免剂量累积与辐射损伤的累积效应；结果相邻的断层图往往缺乏连续性，难以重构样品的整体结构或把握拥挤细胞内部的中尺度背景。当需要背景信息时，可采集中等放大倍数（约 6000×）的断层图，在几分钟内以极低剂量对整块薄片或大 ROI 成像。或者，用拼接式断层成像（montage tomography）采集多组重叠的高分辨率倾转系列，最终覆盖大视场。但拼接设置会带来问题：样品须耐受用于拼接的图像重叠所带来的额外电子剂量；而且拼接的图块缝合与倾转系列融合在技术上仍具挑战，尚未整合进最常用的处理流程（见下文数据处理部分）。
在中长期，类似 SPA 的多载网工作流程有望建立。在多载网框架下实现载网测绘自动化、ROI（如薄片）识别、倾转系列采集目标选择、实时监测与远程报告，将在多方面大有裨益：第一，可靠地、高效地利用最先进的电镜时间，且用户输入最少；第二，确保获得与所研究的表型、事件或特征相关的最高质量数据集，服务于整合结构细胞生物学。此外，把 cryo-ET 与 GisSPA 等 SPA 采集策略结合，为原位高分辨率结构测定提供了有前景的方向。总体而言，这将精简用于公共数据库沉积的数据采集参数，并为更多激动人心的科学发现提供广阔空间。
2.3.3 断层图重构与其他数据处理策略
cryo-ET 的数据处理是一个复杂且快速发展的领域，新方法与常为实验室专用的软件包以很快的速度被引入，却没有一个跨平台的统一方案整合。与 SPA 已有 cryoSPARC 与 RELION 这类被广泛采用、标准化且相对易用的流程不同，cryo-ET 仍缺乏普遍接受的处理管线与明确的最佳实践指南。在社群推动下，Warp 及其 M、RELION 中的持续开发，以及最近全新的 Relay 平台等有前景的进展正在实现中。这种标准化与清晰度的缺乏，仍是新用户的重要障碍，并限制了 STA 方法在原位大分子结构—功能分析中的更广泛采用。
对 cryo-ET 数据处理作全面讨论本身就值得一篇专门综述，因此以下只作简要总结，提示近期的方法学进展与未来展望；对 cryo-ET 处理方法详细描述感兴趣的读者可参阅原文所引综述。
断层图重构通常由几个连续步骤组成：影片帧对齐、倾转系列的全局与局部精修对齐、CTF 估计与校正、剂量加权，以及以背投影或其他迭代方法重构（图 1(6)）。应用最广泛的断层重构软件套件之一是 IMOD，其应用范围很广，包括拼接对齐、断层成像、CTF 校正、滤波、可视化与分割。
历史上，精确的倾转系列对齐依赖基准标记——通常是在玻璃化前加入样品的金珠。这些基准点在整个倾转系列中被跟踪，用于确定高质量断层图重构所需的对齐参数。那时自动批处理在一定程度上已可实现，但相对较慢，且常限于单个或同类数据集。
基于基准点的方法仍然非常有效，但一般不适用于薄片，因为薄片缺乏基准点。这类样品的倾转系列对齐改而依赖图像块跟踪（patch tracking）：在视场内分布的图像区域或扇区中的特征在不同倾角间被跟踪。由于图像块跟踪完全依赖样品的固有内容，其准确度可能受限，特别是在低衬度或异质的情况下。投影匹配方法的引入——先有 Protomo、后有 AreTomo——显著改进了无标记对齐流程：这些方法迭代比较实验投影与中间重构体积的再投影，可实现接近金基准点质量的高精度对齐。此外，AreTomo2 引入了高效的批处理功能，可通过相对简单的命令行界面快速重构大型数据集。最近，整合在 AreTomoLive 中的 AreTomo3 扩展了这一框架，在统一的重构流程内整合了运动校正、去噪、剂量加权与 CTF 校正等额外的预处理步骤。
近期进展还探索了用深度学习做稳健、自动、无监督的断层图重构，如 MissAlignment：它用卷积神经网络基于“质量”评分优化断层子体积的对齐参数；该方法还评估结构信息很少的区域能否少参与优化，从而降低异质样品中伪影的风险。初步结果表明，用这一新方法重构的断层图经 STA 得到的结构，分辨率可与终极的基于参考的对齐方法相当；但计算成本仍然可观，即使以子体积批量处理，目前总时间也约为每个倾转系列 1 小时量级（取决于计算基础设施）。
断层图重构自动化的提高，已使在最少用户干预下实时、在线处理大型数据集成为可能。但在实践中，许多倾转系列含有低质量图像，成因包括污染、样品漂移、荷电，或视场中出现薄片边缘。这类有缺陷的倾角会显著降低最终重构质量。一种常见策略是排除低衬度倾角，这通常足以去除受薄片边缘伪影影响的图像，但对其他图像退化来源效果较差。最近，已提出用深度学习方法在重构前自动识别并排除低质量倾角，这类方法有望推动 cryo-ET 处理管线中全自动质量控制的实现。
下游处理步骤包括用于可视化的衬度增强、目标定位、样品背景表征，乃至最终的定量分析（图 1(6)）。深度学习算法带来的复原方法的可能性，须在适当的对照措施下逐案审慎对待；但它们有助于工作流程的其他方面，并为整合现有众多工具铺路。这些工具包括可视化辅助工具，以及用于颗粒挑选、去噪与缺失楔补偿、图像分割与模式识别、大分子异质性表征的定量方法。与此同时，自动重构与实时反馈回路为 cryo-ET 研究开辟了全新途径，也是充分利用现有 STA 管线、在生理相关背景中直接对大分子作高分辨率结构测定的前提。
3 结论与展望
自发展以来，cryo-ET 已被证明是一项有力的技术，能以中至高分辨率、在接近天然的状态下可视化多种生物样品的分子环境。过去十年，众多软件与硬件发展使工作流程日益自动化，并逐步把瓶颈从获得适合 cryo-ET 的样品转移到以高级处理管线作数据挖掘。关键进展包括：冷冻 FIB 铣削自动化，实现细胞薄片的高通量制备且可重复性提高；用深度学习辅助的目标识别在大面积薄片上自动采集；以及自动化的断层图重构。尽管已有显著改进，通过提取转移技术把 cryo-ET 用于组织样品仍具挑战、速度慢、通量相对低。不过，等离子体 FIB 的发展（铣削更快），加上可由深度学习辅助的自动化提取转移流程的近期进展，为使这一技术更广泛可及、并总体扩大 cryo-ET 的可能产出，提供了有前景的前景。
基于人工智能（AI）的工具正在改变该领域的多个方面。第一，AI 辅助的特征识别正促进样品制备的自动化，如本文上述例子所示。第二，它可通过自动、快速、可靠地瞄准 ROI 以及高效分析大量低信噪比图像，加速并改善数据采集。最后，数据处理也在快速演进，已开发出用于分割、颗粒挑选与原子模型构建的新方法。在原子模型构建方面，AlphaFold 及相关结构预测方法通过促进冷冻电镜密度图的解释与建模已产生特别深远的影响，并将在近期继续对 cryo-ET 发挥这种作用。
此外，若干硬件改进也提供了激动人心的机会。第一，冷冻扫描透射电镜（cryo-STEM）可促进对厚于传统 cryo-ET 薄片的样品的研究，包括厚度超过 500 nm 的样品。第二，把 cryo-SXT 与 cryo-ET 结合的关联方法，可为基于冷冻 FIB-SEM 的破坏性体积电镜“切片-观察”方法提供替代方案，同时在纳米尺度提供全细胞背景信息。最后，激光相位板的发展可大幅提高低散焦值下的图像衬度，可能有助于在拥挤的细胞内容中可视化与识别生物结构，同时保留高分辨率信息。
总体而言，本综述呈现的 cryo-ET 各方面进展显示该领域前景可观。持续的发展很有可能使研究者能研究日益复杂、生理相关的样品，包括结合 SPA 与 cryo-ET 的组织与类器官。此外，新的易用、整合的软件包正逐步缓解 cryo-ET 数据处理对新用户与非专业人员的一大挑战。综合来看，这些进展预期将扩大 cryo-ET 可及的生物系统范围，并提高动态大分子经 STA 可获得的结构数量与分辨率，以及它们在细胞背景中、接近天然条件下的相互作用研究水平。
参考文献
Corroyer-Dulmont, S., Masson, C., & Quemin, E. R. J. (2026). Towards Integrative and Multi-Scale Imaging with Recent Advances in Cryo-Electron Tomography. International Journal of Molecular Sciences, 27(21), 9519. DOI: 10.3390/ijms27219519（DOI 入口）
