作者：孙千 本文转载自公众号：老千和他的朋友们。原文地址：https://mp.weixin.qq.com/s/Yghl6Kg0DFCQ5Ct5mWNB2g
生物样品进入电高真空环境前必须进行“保存“稳定化处理，在各种已开发方法中，投入式冷冻技术能最大程度保持样品接近天然状态因此成为首选方法。
投入式冷冻技术是将样品在载网上铺成薄膜后快速投入低温介质（通常是液体乙烷）中，技术成功关键在于载网和样品性质、均匀薄膜形成、低温介质温度性质以及投入条件的精确控制。
本文系统回顾了投入式冷冻的基本原理、关键技术、仪器设备、常见问题和安全注意事项。
1. 引言
由于电子具有极高的散射截面，电镜中的电子路径必须保持在极高真空状态。因此，生物样品在成像前必须进行稳定化或“保存“处理。
最初开发的生物样品保存方法依赖脱水处理：蛋白质和病毒采用负染技术；组织和细胞先进行化学固定，然后依次进行脱水、树脂包埋、切片和染色。然而，脱水过程会扰乱样品结构，促使研究者寻求通过冷冻来保持样品自然水合状态的方法。
逐渐冷冻的基本问题在于：水会结晶并膨胀，从而变性大分子并扰乱细胞结构。解决这一问题的方法之一是应用高压和冷冻保护剂（“高压冷冻“），以抑制冰晶的成核和生长。
研究者由此产生了一个关键问题：是否可以通过极快的冷却速度，使水或生物分子的重排过程在冰晶有时间形成之前就被冻结？1970年代初期，Taylor和Glaeser进行了开创性实验：他们将水合的过氧化氢酶晶体投入液氮中，发现晶体仍能产生3.4 Å的衍射图案，表明蛋白质结构至少在该分辨率水平上得到了有效保存。
1981年，Dubochet小组取得重大突破：通过将纯水铺成薄层覆盖在标准碳涂层载网上并投入液体乙烷中，成功将纯水冷冻为非晶、类液体（“玻璃态“）状态。这一成果起初遭到质疑，但当研究者将大分子复合物加入水中并证明它们能以天然的“冷冻水合“状态保存时，这一进展对结构生物学的重大意义变得明确。
如今，投入式冷冻技术被广泛应用于研究大分子、药物载体、2D蛋白晶体、细胞分级分离、囊泡悬浮液、纤维、病毒颗粒、细菌、聚合物、基质、胶体、纳米颗粒催化剂，甚至乳化涂料。各种投入式冷冻器和方案已针对不同应用进行了优化。
然而，为冷冻电镜制备样品的过程具有挑战性，通常需要大量优化工作来确定每种样品的最佳冷冻条件。本文详细描述投入式冷冻方案，帮助新手认识这一技术的潜在价值和挑战。
2. 载网和支撑膜
制备冷冻电镜样品的第一步是选择合适的载网和支撑膜。载网本身可由多种金属制成：铜是最常见的选择；金在需要在载网上培养细胞或载网与细胞共存的情况下更适合，因为其毒性较小；钼的优势在于与碳具有相似的热收缩系数，因此冷冻时载网和碳支撑收缩更一致，有效防止“皱纹“现象（Booy和Pawley，1993）。
更小的网格尺寸（载网条之间的更小方块）提供更多支撑，但载网条会遮挡载网上更多区域，特别是在高倾斜角度时。专门的“定位“载网装饰有标记符号，便于标识载网上的特定位置，这在相关光学和电镜中至关重要。
冷冻电镜应用的载网几乎总是涂有薄碳膜。碳膜可分为“连续膜“（无孔）或“多孔膜“。连续碳支撑膜对2D晶体可能更适合，因为保持晶体完全平整比减少背景噪声更重要。多孔碳膜可减少背景噪声，因为样品可单独悬浮在孔上的玻璃态冰中成像。
虽然“‘lacey”载网（实验室制备或购买）具有不规则的不同孔径阵列（图1A），但商业化的QuantifoilⓇ（图1B）和C-flatTM膜具有规则的孔模式，便于自动图像采集。典型孔径约为1 μm，更大的孔可最大化样品成像区域，但每个图像中至少保留一些碳膜（如孔周围的完整外围）有助于更精确地确定离焦值并减少充电效应。
图1 电镜载网类型。(A) 具有不同孔径阵列的Lacey碳支持膜(载网标尺5微米)和(B) QuantifoilÒ载网显示碳膜中规则的孔洞图案(载网标尺20微米)。
实践经验表明，支撑膜的表面性质和完整性因批次而异。因此，建议在使用前测试每批载网中的几个样本。碳膜的完整性可在光学显微镜下轻松检查，包括等离子清洗前后的对比。表面性质可通过使用标准等离子清洗和投入式冷冻方案对载网上的纯水进行投入式冷冻来检验，以确保形成均匀的薄玻璃态冰。供应商可根据特定需求定制支撑膜，例如减少基底气泡形成或通过增加厚度来改善膜稳定性。
3. 载网清洗
新制备的碳膜起初具有亲水性，但随时间推移会变得越来越疏水。因此，通常需要恢复其亲水性，以便液体样品能够均匀分布在其表面。在冷冻电镜出现之前，等离子清洗（也称为“辉光放电“）就被用于改善电镜中各种基材的粘附性质（Dubochet，1971）。
等离子体通过在低真空下电离气体（如空气、氩、氧和氢）或其组合（如氩/氧或氢/氧）产生。等离子体中的自由基与基材表面反应，使载网表面变为亲水性。当液体样品施加到载网上时，它们在表面均匀分布，可被吸印形成仅几十纳米厚的薄膜（Gan，2008）。
在正确清洗的载网上，在湿度控制的投入式冷冻器室中，这种薄样品膜非常稳定，可在载网孔上悬浮数秒。如果等离子清洗不能使膜整个表面均匀处理，液体将不会在载网上均匀分布或吸印，导致某些区域的冰密度不均。例如，可能出现每个载网方格中心冰隆起的现象（图2C）。
图2 等离子体清洁对冰层的影响。(A) 显示冰层厚度均匀的载网连续电镜图谱拼接图。(B) 经等离子体清洁处理的QuantifoilÒ薄膜，孔洞中的冰层薄而均匀（载网标尺1毫米）。(C) 当等离子体清洁失效时，可能的结果之一是在每个载网方格的中心形成致密的冰芯（载网标尺100纳米）。
等离子清洗参数（如室内压力、射频功率、用于形成等离子体的气体混合物以及整体系统几何形状）都应进行探索和优化。每台设备和应用的系统设置可能不同。如果场强过高或辉光时间过长，高能离子轰击可能破坏碳膜。如果真空释放过快，碳膜也可能受损。小有机分子如戊胺和多聚赖氨酸可在离子放电期间以蒸汽形式引入，影响纯化大分子在碳膜和孔上冰中的分配。
清洗后，载网可存储在原始载网盒中，并密封在密闭袋或室中备用。
自制等离子清洗器可能存在危险，因为需要使用高电流、高电压以及创造等离子体所需的专用气体。商业仪器广泛可用，有些专门用于等离子清洗，其他的还提供碳涂层功能。
高级等离子清洗系统，其室可容纳载网清洗以及电镜样品架清洗两个端口。还可以配置使用氢/氧气体混合物，以最小溅射损伤进行清洗，特别适用于清洗脆弱的碳支撑基材。由于氢/氧等离子体的高效率，碳基材清洗时间很短，通常使用氢/氧气体混合物和50 W的RF功率设置15-30秒即可。这样可产生均匀亲水的碳膜，并可保持数周（Melanson，2009）。
虽然等离子清洗是载网清洗的首选方法，但当等离子清洗器不可用时，载网也可浸入乙醇、丙酮或氯仿中，或重新涂覆一层新鲜碳层（Quispe，2007）。载网还可涂覆多聚赖氨酸或其他有机分子来促进细胞粘附。实践发现，更极端的载网处理（如在电镜中过夜“预辐照preirradiation”）可能导致某些大分子复合物异常分配到碳孔内。
4. 制备低温介质
为使水玻璃化，温度必须以超过105 K/s的速度下降（Dubochet和McDowall，1981）。样品必须制成薄膜的原因是样品中水的热导率成为限制因素。样品投入的低温介质必须具备：高热导率以快速从样本中传导热量；冰点低于玻璃化样品所需的温度；以及高沸点和大热容量以防止样品和低温介质之间形成蒸汽层。
虽然环境压力下液氮温度极低（77 K），易于获得且相对便宜，但其热导率仅约400 K/s，因此经常产生结晶冰。因此，最常用的低温介质是乙烷和丙烷，主要因为它们的热导率比液氮高300-400倍（超过13-15 kK/s）。乙烷的冰点为90 K，沸点为184 K，具有高热容量（在94 K时为68.5 J/mol K）。液氮用作主要冷却剂，首先液化乙烷或丙烷，然后在整个过程中维持其冷却状态。
然而，由于乙烷和丙烷的冰点都高于液氮温度，它们在实验过程中会慢慢固化。因此，一些投入式冷冻器配有内置加热元件或特殊设计，限制氮和乙烷/丙烷杯之间的传热，以保持低温介质温度刚好高于其熔点。Tivol等人（2008）发现37%乙烷和63%丙烷的混合物即使与液氮直接接触也能保持液态。这种混合物产生一致的薄玻璃化层，并支持长时间的投入式冷冻操作，无需加热器或特殊杯配置。
载网投入低温介质后转移到液氮储存时，载网上多余的乙烷（或丙烷）会冻结形成固体外壳。通常，这种外壳在后续处理中会从载网上脱落；若未脱落，当载网插入电镜高真空中时会迅速升华。然而，杂质会保留，因此使用高纯度低温介质很重要。较低等级的“露营气体丙烷“含有过多污染物，无法产生洁净样品。
4.1 低温介质冷凝
低温介质以压缩气体形式提供，因此需要液化。这通过将气体缓慢释放到由液氮冷却的杯中完成。气体流量可用配有第二级针阀和喷嘴上窄孔Tygon管的两级调节器控制。通常将移液管尖端插入Tygon管末端，以进一步限制和更好地引导气体流动。冷凝低温介质的典型方案如下：
- 安全准备：在通风罩中工作，穿着实验服和护目镜。
- 预冷设备：将液氮倒入低温介质杯周围空间。当杯子达到至少-175°C时，液氮将停止剧烈冒泡（“莱顿弗罗斯特点“）。根据投入式冷冻器设计，这可能需要5-15分钟。
- 检查准备：在开始冷凝前，确保低温介质杯内没有剩余液氮。
- 调节压力：关闭两级调节器上的针阀和主储罐阀，将第二级气体出口压力调节到约0.14-0.28 bar。使用低压可避免不必要地将气体排放到通风罩中或溅射冷凝的低温介质。
- 插入管路：将连接到气体储罐调节器的管子放入预冷低温介质杯底部（如图3A）。
- 开始冷凝：打开主储罐阀和针阀，允许在预设压力下输送气体。
- 控制液位：当液体到达顶部时，减少气体流量并慢慢拉出管子尖端，快速关闭气体。注意：若在尖端仍浸没时关闭气体，液体会被吸回管中。
- 安全收尾：关闭气瓶上的主储罐阀并排放管线中的剩余气体。始终将气瓶置于实验室安全程序定义的安全配置中。
或者，低温介质可在由液氮冷却的单独容器中冷凝，然后倒入预冷的低温介质杯中（图3B）。
图3 (A) 将低温剂气体通入被液氮包围的预冷杯中来冷凝低温剂。(B) 在单独容器中冷凝乙烷气体后，将液态乙烷倒入冷的低温剂杯中。(C) 通过外部接口重新注入液氮以维持清洁、低温的氮气环境。
4.2注意事项
乙烷和丙烷具有高度易燃性且冷凝时危险性更高，因此严禁在明火环境下使用，应仅冷凝填充低温介质杯所需的最小体积（通常少于10毫升），使用小型储罐并将备用储罐存放在防火柜中，在繁忙实验室中22,650L气体可维持2-3个月使用。
气瓶及两级调节器的订购和安装必须在实验室安全官员指导下进行。液氮需持续补充以维持低温介质温度并提供保护性干氮气层，但应避免液氮溅入低温介质，可使用带屏蔽和外部漏斗的设备如CryoplungeTM 3。
操作时必须佩戴充分的眼面部防护和冷冻手套，因为物理接触可能造成严重冻伤。由于这些低温介质高度易燃、蒸发时体积膨胀超过700倍且存在窒息和麻醉风险（乙烷可引起头晕、头痛、恶心和协调失调），建议在专用通风罩中处理蒸发，投入式冷冻区域应保持良好通风，处理大量低温介质的实验室应配备氧气置换传感器，并通过员工教育、充足防护设备供应和警示标志确保全面安全防护。
5. 载网投入
5.1 基本程序
投入式冷冻过程通常包含三个主要步骤：将含有样本的小液滴施加到载网的碳表面；用滤纸吸印液滴直到只剩下很薄的流体膜；然后将载网投入低温介质。最后将载网存储在定制载网盒的液氮中，直到加载到冷冻电镜中进行成像。吸印可从一侧或两侧进行。单侧吸印在减少吸印纸纤维与在另一侧生长的细胞直接接触方面特别有用（Lepper，2010）。
最佳冰厚度取决于几个因素，包括样本大小、形状以及将要使用的冷冻电镜加速电压。较厚的冰可能提供更多稳定性，但如果要玻璃化的流体样品过厚，冰可能无法玻璃化。如果吸印过多流体，细胞可能脱水。
冰的厚度也会影响颗粒在孔上的分布：大颗粒可能被排挤到膜的更深区域（如孔边缘）。颗粒在非常薄的层中也可能优先取向，部分原因是空气/液体界面的表面电荷（Glaeser，2007）。
温度、湿度、吸印压力和吸印持续时间应为每个样本优化。研究表明，吸印可能损坏甚至杀死大细胞（Lepper，2010）。因此，此类样品应温和吸印更长时间。
蛋白质或细菌投入式冷冻的示例方案：
- 将样品悬浮在水性介质中（如水或低离子缓冲溶液以减少成像期间的背景噪声），蛋白质复合物浓度为1-3 mg/ml或细菌OD₆₀₀为0.5。
- 等离子清洗载网，遵循特定设备用户手册中的说明。
- 用投入式冷冻器提供的镊子固定载网，并将镊子连接到设备上。
- 如果投入式冷冻器有湿度控制室，将湿度设置为100%。
- 将3-5 μl样品施加到载网的碳侧。
- 用1号级滤纸吸印载网1-3秒，以产生厚度小于1 μm的水膜。
- 投入液体低温介质以产生薄玻璃样固体。
- 将载网转移到液氮中标记的四载网槽盒中，小心不要将载网暴露在大气湿气中。
- 载网盒储存在放置于大型氮气冷冻储存杜瓦瓶中的50毫升锥形管内。
投入式冷冻技术的核心在于精确判断低温介质的温度时机，因为气体低温介质刚液化时温度仍偏高，需要进一步冷却才能达到理想状态。液体乙烷的最佳冷冻温度指示是杯底结冰而表面仍有足够液体供载网投入，但这种理想状态持续时间很短。为维持合适温度，可采用乙烷–丙烷混合物、使用温控设备将温度保持在略高于冰点，或定期重熔低温介质，但后者需要插入温热金属杆（有污染风险）或添加室温气体（有溢出风险），都不是理想选择。
在载网操作过程中必须极其小心，绝对不可弯曲载网以免影响其在架中的稳定性，同时要避免载网接触冷冻杯壁，并在充满干氮气的环境中快速将冷冻载网转移至储存架，通过浮动圆柱屏障和专用盖来捕获更多干氮气保护样本。整个过程要求精确温控、小心操作和快速处理的完美结合，相关详细程序可参考Iancu（2006）的文献，供应商和NIH资助中心也提供专业培训课程。
5.2 湿度控制
冷冻实验室中大气湿气有害，会在液氮储存容器和载网样品上形成冰晶，因此潮湿地区需使用通风系统和除湿器将相对湿度降至25%以下，甚至将仪器完全封闭在湿度控制室内，但需注意低湿度可能增加静电。
虽然某些机构要求在通风罩中操作投入式冷冻器，但强空气流可能引入冰污染，建议设置屏蔽并使用自动化设备的盖子促进干氮气流减少污染。所有液氮杜瓦瓶在操作间隙必须保持干燥并配松散盖子，便携式储罐需倒置干燥，可使用30°C干燥培养箱确保组件无湿气，50°C热块干燥小工具，低压实验室空气源干燥固定装置。
然而，样品载网附近区域需要较高相对湿度（通常>80%）防止冷冻前样品干燥，这在吸印过程中尤为重要，因为蒸发和表面界面影响静电力和大分子组织，40%湿度会造成渗透不平衡导致脂质体倒转，并可能影响病毒衣壳复合物的表面相互作用和优先组织，因此商业投入式冷冻仪器通常提供控制温湿度的环境室。
5.3 仪器设备
早期投入式冷冻器多为实验室自制的临时支架和泡沫塑料盒基本构造，最早的设计之一是简单的枢轴精细镊子持有碳涂层载网，载网在重力弧中下落经过雾化雾喷射，连续碳基材收集微细液滴并在粘稠乙烷锅中玻璃化，第一个玻璃态水图像就是这样制备的（Dubochet和McDowall，1981）。
随后碳基材被移除发展出“裸载网“方法成为无支撑液膜的前身，Dubochet小组1980年代设计了弹性驱动杆支撑金电子电路销的投入式冷冻器，配合水驱动磁力搅拌棒保持乙烷流动成功玻璃化样品。
现代投入式冷冻器虽更复杂但设计仍归功于这些早期原型和多年实验室经验。获得良好冷冻水合样本的关键是产生均匀薄的玻璃化冰层，早期许多“自制“设备需要手动吸印载网，虽可获得高质量结果但变化较大且成功依赖个人技能。
重力浸入器依靠重力将载网投入低温介质，提供更多用户控制，对于载网上生长细胞的实验可避免自动浸入器双侧苛刻吸印压力将粘附细胞“剥离“的风险，用户可从载网背面吸印让液体通过碳中的孔流入滤纸，典型做法是从一侧用滤纸吸印直到液体停止吸入，但应为每个样品测试不同吸印时间。
图4 (A) 手动投样器（德国马丁斯里德马克斯·普朗克研究所生物化学系定制）置于生物安全柜中。(B) 投样前手动从载网背面吸去多余液体。
重力浸入器便携且适用于现场冷冻样本，但缺乏环境控制室导致载网暴露于大气湿度温度中，且用户面临尖锐镊子和生物样品的安全风险，现代手动浸入器通过内置照明辅助吸印可视化和脚踏板控制镊子释放来改善操作。
自动化投入式冷冻器旨在提高效率和可重现性，通过精确控制湿度、吸印压力和持续时间等多个参数消除玻璃化冰层厚度变异性，并提供参数选择存储调用功能和多种用户安全保护功能。
1990年代末Peter Frederik博士和Paul Bomans开发了第一个完全自动化计算机控制的投入式冷冻器VitrobotTM Mark I，成为FEI公司“玻璃化机器人“系列的开端，新版VitrobotTM Mark IV可将载网投入液体样品或允许样品从侧面开口用移液器滴入载网。
图5 各种自动投入式冷冻器。(A) VitrobotTM Mark IV。(B) Leica EM GP。(C) CryoplungeTM 3。(D) EMS-002快速浸入式冷冻器。
市面上其它的投入式冷冻器包括与Gunter Resch博士合作开发的Leica EM GP（提供细胞单层单侧吸印和体视显微镜监控功能）、Gatan公司的CryoplungeTM 3（多功能半自动化设备，具备定时吸印、可拆卸湿度室、液体乙烷温度控制和冷冻工作站屏蔽保护功能）以及Electron Microscopy Sciences的快速浸入冷冻器（需手动吸印但便携经济，提供环境室、低温介质温度控制和冷冻替换功能）。
研究者应根据结果一致性、控制参数和总体成本等标准选择最适合需求的设备类型，许多实验室会根据制备不同样本的功能要求使用几种不同类型的浸入器。
5.4 安全注意事项
多人共享投入式冷冻器时应建立良好操作规范，包括每次使用前后用70%乙醇对机器表面和机械部件去污，在数据库中保持准确样品历史记录并告知员工日常冷冻计划。冷冻程序中应仅培养使用微升体积并在安全罩中遵循无菌技术，对于生物危险样品可通过过夜热循环对自动化投入式冷冻器室进行去污，而手动浸入器可整机放置在隔离房间的生物安全柜中。
使用手动浸入器时需注意脚踏板位置避免镊子过早释放并保持手指远离尖锐镊子，相比之下自动化投入式冷冻器由压缩空气控制且具有封闭室因此用户被镊子伤害的可能性较低。应为新员工提供培训和年度复习实验室安全课程确保操作安全。
6. 常见问题及其诊断
理想情况下，载网上的冰应该是均匀、薄且玻璃态的。如果冰和嵌入样品过厚，或有过多污染，电子将无法穿透载网。如果冰至少足够薄以允许电子穿透，电子衍射可用于评估冰的质量。
玻璃态冰的特征是缺乏可检测的结晶结构，最接近水的液态。它是电子成像的首选“冰“形式，被认为对结构损坏最小。然而，在冷冻、转移和加载程序中有许多点可能导致形成破坏性的六角形或立方冰晶：由于低温介质过热或热导率低导致样品冷却缓慢；低温介质或储存液氮中漂浮的污染冰；或冷冻样品在储存或转移期间的任何时候加热到高于-135°C的温度。
污染冰可能在载网从低温介质转移到储存容器期间或加载到电镜期间粘附到样品上。在这些操作点应小心保护载网，始终将其保持在液氮中，限制暴露在大气湿气中，并在使用工具操作载网前始终在液氮中冷却工具。
六角形冰是地球上最常见的冰，当水分子在其四面体结构的每个点相互附着并无限延伸时形成。这种键合分子的增殖可能严重损坏细胞超微结构。六角形冰可能在缓慢冷冻期间形成（结晶冰条纹，如图6A所示），或可能在冷冻后以离散球形斑点的形式冷凝。
图6 劣质冰的实例。(A) 围绕细菌的六方冰，箭头所示。(B) 立方冰污染，箭头所示。(C) 极度复温的结果：水分流失和结构细节丢失。网格标尺 = 0.5 um
立方冰与六角形冰非常相似，但相邻水分子的键角旋转180°，使其只在-70°C以下稳定。立方冰晶的尺寸范围从30 nm到1 μm，通常看起来像细粒斑点（图6B）。虽然立方冰不倾向于对样本造成广泛结构损坏，但它可能导致破坏图像的背景噪声。作为参考，三种冰形式及其衍射模式可在Dubochet等人（1988）的里程碑文章中找到。
在投入式冷冻过程中需要做出许多决定并控制多个条件，以期在薄玻璃态冰中创造保存良好的样品。然而，当过程有效时，可获得样品的高分辨率结构细节，回报可能很大。图7演示了在不同样品中可达到的细节水平。
图7 良好冰层的实例。(A) 被金标记颗粒包围的细菌，金标记颗粒用于校准断层扫描倾斜系列图像（网格标尺0.5um）。(B) 微管（网格标尺 = 75纳米）。(C) 用Fab片段标记的鼻病毒颗粒（网格标尺 = 50纳米）。
参考资料
1 Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., and McDowall, A. W. (1984). Cryo-electron microscopy of viruses. Nature
2 Dubochet, J., and McDowall, A. (1981). Vitrification of pure water for electron microscopy. J. Microsc. 124,
3 Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., and Schultz, P. (1988). Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21,
4 Dubochet, J., Ducommun, M., Zollinger, M., and Kellenberger, E. (1971). A new preparation method for dark-field electron microscopy of biomacromolecules. J. Ultrastruct. Res.
5 MeganJ.Dobro. Plunge Freezing for Electron Cryo-microscopy Methods inEnzymology 2010
