作者：Mark Webber1，Elaine Humphrey2
1 加拿大BC省加利亚诺岛(Galiano Island)硅藻资深研究员
2 美国显微学会会士，前加拿大显微学会主席，现任加拿大维多利亚大学高级显微镜中心项目经理
现有方法存在哪些问题？
硅藻壳面和壳环带面（即带面）的显微形态是属、种水平硅藻鉴定的重要依据。常规扫描电镜（SEM）观察硅藻样品的方法是将硅藻样品去有机质处理后置于平整载体（如玻片、扫描电镜样品座、碳导电胶、滤膜等）上观察，其缺点是：
- 通常仅能观察到硅藻一个角度（壳面方向或带面方向）上的结构，而该角度多数情况下不是拍摄硅藻照片或鉴定硅藻种类的理想方向（见图1）；
- 为满足鉴定要求，需寻找角度理想的硅藻或者倾斜和旋转样品座、调节电镜参数以观察硅藻不同方向上的结构（实际上仍难获得理想的拍摄角度），而这些过程需花费大量的时间。
常规光镜（LM）观察方法同样存在上述缺点。
图1 显示了使用表面平整的铝样品座观察硅藻的局限性
（a）一种羽纹纲淡水硅藻，仅能观察到壳面结构，即使完全倾斜样品座，也不能看到带面结构，比例尺=5μm
（b）一种海洋硅藻-骨条藻（Skeletonema sp.），仅能观察到带面结构，即使倾斜样品座，也不能看到壳面结构，比例尺=10μm
解决方法
利用钻石刻刀在扫描电镜铝样品座上划网格，然后让硅藻样品随机地以不同角度落在样品座表面及所刻的槽内，籍此在光镜和扫描电镜下能快速地获得硅藻种类鉴定所需的壳面和带面结构信息。
具体过程
1、 在铝样品座上刻槽
2) 用双蒸水（DDW）去除残留的碎屑；
3) 将样品座固定于图2a所示的夹具内；
4) 以钢尺为标尺，持图2a-c所示的钻石刻刀在样品座上刻网格状的槽（图2d-f），槽的宽度为20-125μm，槽之间的间隔小于1mm；注意刻槽时，钻石刻刀与样品座表面垂直，控制好力度使所刻槽的宽度、深度均匀，满足硅藻观察的需要；
5) 用润湿后的1200目碳化硅砂纸轻轻打磨样品座，去除刻槽过程中产生的棱角；
6) 将样品座放入肥皂液中刷洗，再用双蒸水淋洗；
7) 待样品座干后，利用硬工作台上折叠放置的纸巾将样品座表面抛光；或者用14000目（1-2μm）的金刚砂轮或金刚砂片抛光；
8) 用100%的乙醇清洗样品座；
按上述过程制作一个样品座，大约需6-10min。
2、 放置硅藻样品
2) 洗涤：用足量的双蒸水去除清洁过程中所使用的盐（例如，使用家庭用漂白剂清洁，容易在样品座和样品上产生大量的盐，双蒸水用量为100-150mL；用过氧化氢清洁，产生的盐少，双蒸水用量相应减少）；
3) 离心：1600rpm转速下离心30-40min，对于坚硬的圆筛藻属，可在3000rpm转速下离心30min，而对于纤弱的双尾藻属，最好采用自然沉降的方法，沉降时间为2h以上；
4) 加双蒸水或双蒸水/乙醇混合液（50–80%乙醇），吸取硅藻悬浮液滴在样品座上，使用乙醇混合液的好处在于：无需使用烘箱，减少样品干燥时间；促进样品运动，避免堆积，增大硅藻以不同角度沉积在样品座上的概率；
5) 自然干燥，过夜。（如使用烘箱，则在60°C下放置10-15min）；
6) 在立体显微镜下检查硅藻位置、数量及分布情况，为满足电镜观察的要求，硅藻数量应足够多，且无堆叠现象；
7) 镀膜：在样品座上镀Au/Pd或Au膜，厚度为8-15nm，以提高SEM观察时的信噪比，避免荷电现象发生；
8) 扫描电镜观察、拍照。
图2 在SEM铝样品座上刻槽
（a）夹具，钢尺，刻槽
（b）钻石刻刀
（c）刀尖
（d）刀尖角度
（e）常规的SEM铝样品座
（f）网格状凹槽
结果展示
如图3-图7所示。
图3
（a）分散在网格状样品座上的海链藻（Thalassiosira punctigera），比例尺=75μm
（b）无需倾斜SEM样品台，a中心的2个海链藻（Thalassiosira punctigera），比例尺=20μm
（c）分散在凹槽内的布氏双尾藻（Ditylum brightwellii）（箭头方向），凹槽宽度为70–125μm，凹槽之间的间距为200–800μm，比例尺=500μm
（d）c中凹槽内的布氏双尾藻，其壳面朝上，单箭头指向硅藻位置，双箭头显示凹槽的宽度为73μm，比例尺=20μm
图4
（a）中心纲盒形藻（Biddulphia antediluviana）立体显微镜照片，壳面和带面结构均可见，比例尺=75μm
（b）凹槽内的中心纲盒形藻（Biddulphia antediluviana）带面方向的SEM照片，比例尺=10μm
图5
（a-b）凹槽内的海洋硅藻-骨条藻（Skeletonema sp.），壳面和带面结构均可见，黑色箭头显示凹槽宽度为176μm，a、b中的比例尺分别为20μm、10μm
图6
（a）凹槽内的卵形藻（Cocconeis sp.），壳面朝上
（b）卵形藻（Cocconeis sp.）的内部结构，需略微倾斜SEM样品台，比例尺=20μm
图7 立体显微镜拍摄的硅藻照片，比例尺均为100μm
（a）中心纲海链藻（Thalassiosira sp.），角度特殊，可见带面结构
（b）凹槽内的海洋硅藻-具槽帕拉藻（Paralia sulcata），壳面、带面结构均可见
结论
该方法使用具有网格状凹槽的样品座，简单、快速、经济，与使用平整载体的常规方法相比，更有利于全面观察硅藻显微形态。
（翻译：胡孙林）
原文链接：
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