作者：孙千 本文转载自公众号：老千和他的朋友们。原文地址：https://mp.weixin.qq.com/s/q-SZCdMdB8cUeSKIeyM86w
扫描电镜(SEM)自问世以来，已成为材料科学、生物学等领域不可或缺的研究工具。然而，常规扫描电镜(CSEM)在样品制备及成像方面存在明显局限：需要高真空环境、样品必须导电或经过导电处理（低电压成像可不镀导电膜），且必须处于干燥状态。这些限制极大地约束了其在某些领域的应用潜力，特别是对于湿态样品或绝缘材料的研究。
环境扫描电镜(ESEM)技术的出现，为克服这些限制提供了新的解决方案。
ESEM与CSEM的技术差异
传统CSEM通过在高真空环境下，将电子束以光栅方式扫描样品表面，并收集样品发射的电子来实现成像。这些电子主要包括两类：一是低能二次电子(≤50 eV)，由非弹性碰撞产生；二是背散射电子(>50 eV)，来自接近180°散射的弹性碰撞。CSEM要求整个电镜腔室维持高真空状态，以避免空气分子对电子束及发射电子的干扰。
相比之下，ESEM在保持电子枪区域高真空的同时，允许样品室内存在低压气体环境，最高可达约4000Pa。这种差异化设计通过差分抽气技术实现，形成从电子枪到样品室的压力梯度(如图1a所示)。
图1 ESEM)示意图。a,ESEM中的不同压力区。电子枪可以保持在高真空状态，而通过差分抽气和限压光阑系统，可使腔室维持在几托甚至更高(1托=133帕)的压力下。
这一创新使ESEM能够在接近大气压的环境中观察样品，从而为研究湿态样品和非导电材料提供了可能。
ESEM的核心技术优势
ESEM相较于CSEM的优势主要体现在两个方面：首先，ESEM能够在气体环境下直接观察湿态样品，尤其是当气体为水蒸气时，可以保持样品的天然水合状态。这一特性显著简化了样品制备流程，避免了传统SEM中复杂的干燥、固定等处理步骤，极大地减少了人为因素对样品结构的干扰。
其次，ESEM解决了非导电样品观察中的电荷积累问题。在气体环境中，由电子束与气体分子碰撞产生的离子能够漂移回样品表面，中和累积的负电荷，从而消除了对绝缘样品进行导电镀膜处理的需求。这不仅简化了样品制备过程，还保留了样品的原始表面形貌和化学性质。
ESEM的工作机理与信号检测
气体环境下的电子传输机制
在ESEM中，电子束需要穿过气体环境到达样品表面。令人好奇的是，为何气体存在不会严重影响成像质量？这是因为ESEM通过精心设计，将电子在气体中的传播距离限制得尽可能短，使大多数入射电子避免发生大角度散射。这种设计形成了一个锐利的中心探针，周围伴随着较宽的“电子裙“，本质上构成一种背景直流信号。
虽然这会导致信噪比下降，使图像质量略有降低，但目前ESEM可实现的最佳分辨率已达到约1.3纳米，对于大多数应用而言完全可以接受。
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独特的信号检测机制
ESEM中的气体不仅扩展了可研究的样品范围，还在信号检测过程中扮演关键角色。当样品发射的电子(特别是低能二次电子)穿过气体层时，它们与气体分子发生碰撞，产生电离效应，触发级联放大过程(图1b)。随后，这些电子被带有正偏压的专用检测器捕获。
图1 b,级联放大过程。此过程发生在腔室内，其中气体分子被样品发射的电子电离。每次电离碰撞都会产生一个次级电子，该电子与原始电子一样，被加速朝带正电的探测器运动，在到达探测器的途中可能发生进一步的碰撞。正离子则漂移回样品表面。
值得注意的是，ESEM使用的检测器与CSEM中常用的Everhardt-Thornley检测器不同，后者无法在高气体压力下正常工作。
原始的ESEM(由FEI/Philips开发)通过检测气体中的电荷流来采集信号。随后，市场上出现了更多所谓的“可变压力-VP”电镜设备（例如 “WET SEM”、“LV-SEM”、“Natural SEM”、“ECO-SEM”、“VP-SEM “等），尽管这些仪器通常在较低压力下运行，无法像ESEM那样完全保持水合样品的自然状态。
ESEM在材料研究中的应用
湿态样品的原位观察
ESEM最显著的优势之一是能够对湿态样品进行原位观察。为了实现这一目标，需要精确控制样品室内的温度和压力条件，使其保持在水的饱和蒸汽压曲线上或附近(图2)。在室温条件下，维持饱和水蒸气压需要较高的气压，实际操作中较为困难。因此，最佳方案是将样品温度降至略高于冰点，此时仅需适度气压即可稳定水分含量。这通常通过配备珀尔帖冷却芯片的样品台来实现。
图2 水的饱和蒸气压与温度的关系。图中显示了ESEM的有效工作条件范围；可以看出，通过对温度进行微小调节即可改变样品的状态。
图3a展示了聚甲基丙烯酸甲酯乳胶的胶体分散液，其中直径约250纳米的球形颗粒漂浮在连续水相中。通过ESEM，研究者可以观察到颗粒的布朗运动，以及颗粒间的相互作用和聚集过程。通过精确调控温度和压力条件，可以在观察过程中实时改变样品的水合状态，研究颗粒聚集行为(图3b)。这种能力使ESEM成为研究胶体系统、水泥材料以及表面现象的理想工具。
图3 不同条件下胶体分散体系的ESEM图像。a,250纳米聚甲基丙烯酸甲酯乳胶颗粒在水中的胶体分散体系。这些颗粒发生布朗运动并可能相互碰撞。
图3 b,相同的颗粒现在分散在0.078 M硫酸镁溶液中。在这种溶液中，粒子间势发生改变，使得任何碰撞都会产生相当高的粘附概率，随着聚集过程的进行，形成分形结构。聚集体的具体特性强烈依赖于盐的浓度；在没有任何盐的情况下，粘附概率较低，形成的是胶体晶体而不是分形结构。
绝缘材料的无镀膜成像
ESEM在绝缘材料研究中具有独特优势。传统CSEM需要对非导电样品进行金属镀膜处理，这不仅增加了样品制备复杂度，还可能掩盖样品表面的精细结构或改变其化学特性。ESEM通过气体电离中和电荷积累，能够直接对未处理的绝缘样品进行高分辨率成像。
这一特性使ESEM在陶瓷材料、天然纤维、复合材料等研究领域发挥重要作用。例如，在水泥水化研究中，ESEM能够观察水化过程中的微观结构演变；在天然纤维研究中，可以在保持纤维部分水合状态的条件下研究其表面特性和微观结构(图5)。
图5 在圆柱形横截面的纤维素纤维上凝结的水滴的ESEM图像。标尺代表50微米。这种图像在液滴边缘显示出更清晰的轮廓（呈波纹状形状——即表面具有恒定的非零平均曲率），与光学显微镜相比，可以更容易地测定接触角。
动态原位实验
ESEM样品腔可视为一个微型实验处理单元，允许研究者在观察过程中改变样品状态。通过调整温度、压力或引入反应气体，可以实时观察材料在不同条件下的行为和转变过程。这种动态原位实验能力已应用于多个研究领域，包括但不限于：
胶体系统的干燥和成膜过程(图4)。朗格缪尔膜在气–水界面上的形成与结构演变
水在固体表面的凝结与接触角测定(图5)。材料在不同湿度条件下的水合/脱水行为，以及矿物与岩石在模拟环境条件下的风化过程。
图4 部分脱水乳胶的ESEM图像。该乳胶由成膜颗粒组成，这些颗粒由甲基丙烯酸甲酯和2-乙基己基丙烯酸甲酯的共聚物构成。在脱水的这个阶段，每个颗粒周围仍有一层薄薄的水膜，颗粒尚未开始融合。
ESEM在生物学研究中的应用与挑战
ESEM在生物学领域展示出巨大潜力，其最大优势在于可以在接近天然状态下观察生物样品，无需进行脱水、固定、镀膜等可能引入人为因素的制备程序。这使得研究者能够更真实地观察生物结构的原始形态。
然而，与材料领域相比，ESEM在生物研究中的发展相对滞后，主要原因是进入该领域的研究者较少。此外，目前尚不明确是否可以在不损伤活细胞的情况下对其进行观察。虽然在低放大倍数下电子剂量较低，可能提高细胞存活的可能性，但这也削弱了与光学显微镜相比的成像优势。
尽管如此，对于需要电子显微镜级别分辨率的生物医学研究而言，ESEM提供了一种减少样品制备人为因素的重要选择。研究者可能会观察到与传统方法有所不同的结构形态，这不应被视为ESEM的缺陷，而是传统制备方法可能改变了样品的真实状态的证据。
绝缘材料无镀膜成像的优势
样品原始特性的保留
对于绝缘样品，如干燥的陶瓷、聚合物和半导体材料，ESEM最显著的优势在于免除了导电镀膜的需求。传统SEM中，为防止充电效应，研究者通常需要在样品表面沉积纳米级别的金、铂或碳等导电材料。这一预处理步骤不仅增加了实验复杂度，更为关键的是，镀膜会不可避免地掩盖样品表面的精细结构，尤其是纳米尺度的形貌特征。
ESEM通过在样品腔室中引入特定气体（通常为水蒸气），在电子束作用下产生正离子，这些离子能有效中和样品表面积累的负电荷，从而在保持样品原始状态的条件下实现高分辨率成像。这一特性对于需要精确表征表面结构的研究至关重要，如多孔材料的孔隙形态、晶体材料的晶面特征，以及聚合物材料的微观结构等。
动态过程的实时观察
无需镀膜的另一显著优势在于可实现样品动态变化的连续观察。在传统SEM中，一旦样品发生物理或化学变化，新暴露的表面若为绝缘体，将立即产生充电效应。而ESEM则可以持续观察变化过程，而不受充电问题的干扰。
这一特性使ESEM成为研究材料在各类刺激下响应行为的理想工具。例如，机械变形过程中的裂纹演化、热处理中的相变现象、化学反应导致的表面形貌改变等，均可在ESEM中获得连续且高分辨的观察记录。此类研究为理解材料的结构–性能关系提供了宝贵的直接证据。
温度依赖性应用研究–高温环境下的绝缘体研究
对于诸多绝缘材料，尤其是陶瓷与特定聚合物，高温环境下的微观行为研究具有重要学术与工业价值。ESEM在这一领域展现出显著优势，可将样品腔室转变为一个微型反应器，在精确控制的温度与气氛条件下，实时追踪材料变化。
以陶瓷材料为例，相变过程通常伴随着晶体结构与表面形貌的显著变化。在ESEM中，研究者可观察到陶瓷原料从非晶态向晶态转变的完整过程，包括成核、晶粒生长、晶界形成及演化等现象。这些观察对于优化陶瓷制备工艺，提升产品性能具有直接指导意义。
值得注意的是，ESEM在高温研究中的优势不仅限于绝缘体，对于金属材料的氧化、腐蚀等过程同样具有重要应用价值。通过在腔室中引入特定反应性气体，如氧气或水蒸气，可模拟材料在服役环境中的演变行为。甚至仅引入痕量气体，也能诱导特定的表面反应，为材料科学研究提供丰富的实验可能性。
低温应用的潜力与挑战
理论上，ESEM同样适用于低温条件下的材料研究。然而，冷冻ESEM的应用发展相对缓慢，在文献中的报道较为有限。这主要受制于技术实现的复杂性，包括样品冷冻过程中的结冰伪影控制、样品转移系统的设计，以及低温条件下气体环境稳定性的维持等挑战。
随着冷冻转移装置与ESEM镜筒设计的不断改进与整合，低温ESEM技术有望在未来取得突破性进展。这将为研究水基材料、生物样品以及低温相变过程提供新的强大工具。潜在的应用领域包括低温电子器件的工作机制研究、低温条件下的电池材料行为、冰晶形成与演化过程，以及生物组织在低温保存条件下的微观结构变化等。
机械测试中的应用前景
ESEM在材料机械性能测试方面展现出独特的优势。传统的机械测试中，样品在应力作用下发生形变，新暴露的表面若为绝缘体，在电子显微镜观察中将产生严重的充电问题。而ESEM中，由于气体电离产生的正离子可持续中和新生表面的负电荷，因此能够连续观察变形过程中的微观机制。
这一特性使得ESEM成为研究材料断裂行为、疲劳机制、应变局域化现象以及微观结构与宏观力学性能关联的理想平台。例如，在复合材料研究中，ESEM可直接观察纤维与基体间的界面失效过程；在金属材料研究中，可追踪位错运动与裂纹扩展的动态行为；在陶瓷材料中，可揭示脆性断裂的微观机制。
尽管ESEM在机械测试方面的研究报道目前相对较少，但随着原位测试技术的发展及ESEM系统性能的提升，这一领域的文献数量预计将显著增长。研究重点可能集中于开发更精确的微纳米级原位力学测试装置，以及解析在复杂环境条件下材料的力–热–化学多场耦合响应机制。
ESEM图像的解释挑战
传统解释框架的适用性
迄今为止，ESEM图像的解释通常沿用了传统CSEM的理论框架，即认为二次电子信号主要反映样品的表面形貌信息，而背散射电子信号则主要反映材料的原子序数分布。在大多数实验条件下，这一解释框架确实适用，使得研究者能够从ESEM图像中获取样品的基本形貌与成分信息。
然而，随着对ESEM成像机制研究的深入，研究者逐渐认识到，气体环境的引入使得电子–样品–气体三者之间的相互作用变得更为复杂。例如，背散射电子与气体分子碰撞可能产生额外的二次电子，这些电子虽然对总信号的贡献相对有限，但在特定条件下仍会对图像形成产生影响。
加速电压对ESEM图像的影响机制与CSEM相似——更高的电压使电子能够更深地穿透样品，提供更多的内部信息，但会降低表面细节的分辨率。然而，在某些特定条件下，ESEM中观察到的现象难以仅从传统理论解释。例如，当乳胶薄膜逐渐失去水分时，其颗粒边缘呈现出特殊的明亮环状结构，这种现象难以单纯从形貌因素解释，表明在ESEM图像中，存在其他影响衬度形成的机制。
复杂衬度机制的探索
随着对绝缘材料研究的深入，科学家发现ESEM中的图像衬度形成机制远比最初设想的复杂。一系列研究表明，ESEM能够展现一些在传统SEM中被金属镀膜掩盖的衬度信息，这些信息与样品的本征电子特性密切相关。
当前对ESEM衬度机制的理解尚未完全统一，但普遍认同的是，衬度的产生与电子产率(electron yield)的变化密切相关。一种解释认为，这种变化源于生成的电子在传播到样品表面的过程中，因为局部电子结构差异而经历不同的能量损失过程。这一机制使得ESEM能够区分半导体中的掺杂浓度差异、可视化绝缘体中的铁电畴结构，以及区分化学性质相似的不同聚合物。
以双嵌段共聚物为例，ESEM能够清晰展示其层状相中的显著衬度，这种衬度来源于聚合物内部的电子特性差异，而非简单的形貌或成分变化。同样，在水铝石等矿物样品中，观察到的衬度通常被归因于“电荷衬度成像(CCI)”机制，这一现象表明局部电荷积累影响了二次电子的产生率，而这种效应与矿物中的杂质分布密切相关。
图6 聚苯乙烯–聚异戊二烯嵌段共聚物的ESEM图像，其中聚苯乙烯的体积分数约为50%。在这种情况下，聚苯乙烯形成较暗的片层。与传统的对其中一相进行染色（例如用四氧化锇）的方法相比，这种方法的优点是无需样品制备，并且避免了由染色引起的膨胀等人为因素。图像由英国谢菲尔德大学A.J.Ryan和C.Salou提供。
然而，衬度形成的完整机制远比单一因素解释复杂。有效的二次电子产率是多参数的函数，不仅依赖于样品内部的电荷移动性，还与腔室气体环境中的离子行为直接相关。研究发现，气体离子并非完全被动地中和表面电荷，它们通过与发射电子的复合作用，影响了进入探测系统的有效电子数量，从而对最终图像的衬度产生影响。
这种动态过程为ESEM衬度研究带来了更多挑战，同时也为新型表征方法开辟了可能性。虽然目前对ESEM中衬度形成的完整机制尚未完全阐明，但其在材料表征中的潜在价值毋庸置疑，特别是在研究绝缘材料的电子性质、缺陷分布以及相界面特性等方面。
ESEM技术前景与发展方向
当前局限性分析
那么，ESEM的未来是什么？尽管ESEM在材料表征领域展现出广阔前景，但当前技术仍存在若干亟待解决的问题。首要挑战在于探测器性能的局限性。真正意义上的ESEM主要依赖于电子信号检测，但现有探测器难以实现纯二次电子的选择性检测，背散射电子探测器的性能同样有待提升。对于可变压力SEM(VP-SEM)的其他变种，探测器相关研究更为匮乏。
探测器设计无疑是未来ESEM技术改进的重点方向之一，突破性的探测器技术有望显著提升信号质量与成像能力，为更精确的材料表征提供支持。
另一技术瓶颈在于定量分析能力的不足。虽然ESEM具备与CSEM相似的能谱分析(EDS)功能，但气体环境的存在使得光谱解释过程更为复杂。同时，电子图像中观察到的衬度变化虽然反映了样品局部特性的差异，但当前尚无法将这些衬度信息进行精确定量，用于相组成的准确识别与表征。
这些挑战指向了未来研究需要重点解决的几个核心问题：二次电子产率如何受样品局部特性与操作参数的定量影响，以及如何在当前探测器技术条件下，将电子产率的变化转化为可靠的定量分析信号。
多技术集成与应用拓展
尽管面临诸多挑战，ESEM展示样品真实电子发射特性的能力（无镀膜掩盖）使其在非均质绝缘体研究中具有无可替代的优势。在某些方面，ESEM与低电压FESEM展现出相似的表征能力，但ESEM不受高真空条件的限制，这为其应用领域开辟了更广阔的空间。
未来ESEM技术发展的一个重要方向是多技术集成与应用拓展。例如，WetSTEM（湿态扫描透射电子显微技术）、EBSD（电子背散射衍射）、WDS（波长色散X射线光谱）、EDS（能量色散X射线光谱）、拉曼光谱、EBIC（电子束感生电流）、CL（阴极发光）等表征技术已开始与ESEM平台进行集成，为材料研究提供多维度、多尺度的综合信息。同时，各类原位测试技术，如拉伸台、加热台等的集成，进一步拓展了ESEM的应用范围。
俄亥俄州立大学电镜中心的Quattro ESEM（俯视图）
A) 用于冷却和加热台的平台冷却器，B) EDAX Octane Elect EDS 探测器，C) EDAX Velocity EBSD 探测器，D) 可伸缩BSE探测器，E) ET探测器，F) 快速电子束消隐器，G)低真空二次电子探测器，H) 可伸缩 STEM 探测器，K) Horiba 全光谱CL探测器（全色探测器、多光栅、CCD 和 InGaAs 探测器）。L) 低温用气锁，M) 冷阱， O) 液氮冷台 CryoMAT，P) Kammrath-Weiss 拉伸/压缩平台
可以预见，随着技术的不断进步，ESEM将在越来越多的材料研究领域发挥重要作用。尽管目前衬度形成机制还未被完全解析，但ESEM在样品制备简化、动态实验条件控制以及特殊信息获取方面的优势已经得到广泛认可。对于复杂的湿态样品，实验设计与参数控制可能仍具挑战性，这也是当前使用该技术的研究群体相对有限的原因之一。然而，随着技术的成熟与应用经验的积累，ESEM有望吸引更多研究人员的关注与应用，为材料科学与工程领域的创新研究提供强大支持。
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