作者：孙千 本文转载自公众号：老千和他的朋友们。原文地址：https://mp.weixin.qq.com/s/8S2R0g1tfpVzA27G2VOaxw
拉曼散射的本质是激发光子与分子间的非共振相互作用，这种作用机制决定了其信号强度天然微弱，在常规测量几何结构中，可探测的拉曼光子数量极为有限。
对于共聚焦拉曼显微镜而言，额外的挑战来自于“共聚焦” 设计——为实现高空间分辨率，系统通过小针孔限制检测体积，这使得进入探测器的信号进一步减少；同时，为获取样品的空间分布信息，需要在短时间内完成数千个甚至数万个光谱的采集，这对信号采集效率提出了严苛要求。
因此，要实现成功的共聚焦拉曼实验，必须从两个核心维度进行优化：一是精心设计激发与检测光学系统，确保激发光高效聚焦到样品且拉曼散射光能最大程度被收集；二是选择适配的光谱仪与探测器，以实现对微弱信号的高效捕捉与快速处理。
随着相关技术的不断演进，当前的拉曼设备已在信号采集效率、成像速度与分辨率上实现了显著突破，为复杂样品的分析提供了有力支撑。
发展历程：从基础发现到成像技术演进
共聚焦拉曼显微镜的发展离不开关键技术节点的突破，其历程可追溯至一个世纪前。
1928 年，印度物理学家 Chandrasekara Raman 首次发现了拉曼效应，这一发现为拉曼光谱技术奠定了理论基础，Raman 也因此在 1930 年获得诺贝尔物理学奖。然而，受限于当时的光源技术，常规拉曼光谱实验难以开展，技术应用陷入停滞。
直到 20 世纪 60 年代，激光技术的发明（如 T. Maiman 于 1961 年获得专利的激光装置）彻底改变了这一局面 —— 激光具有高单色性、高亮度的特点，为拉曼散射提供了理想的激发光源，使得常规拉曼光谱实验从理论走向现实。
20 世纪 70 至 80 年代，电荷耦合器件（CCDs）的发明成为另一重要里程碑。Willard S. Boyle 和 George E. Smith 因这一发明获得 2009 年诺贝尔物理学奖，CCD 探测器凭借在可见和近红外光谱区的高量子效率（远高于传统的光电倍增管 PMTs）以及多通道检测能力，逐步取代 PMTs，将拉曼光谱的测量时间至少缩短了三个数量级。此前，PMTs 作为点探测器，仅能通过扫描获取特定波长的拉曼信号，而 CCD 可同时采集数百甚至数千个通道的信号，极大提升了检测效率。
图 | Willard S. Boyle与George E. Smith，CCD芯片结构
进入20世纪90年代，拉曼光谱技术与光学显微镜实现了深度融合——企业首次将拉曼光谱仪与光学显微镜结合，开发出 “显微拉曼光谱” 技术。该技术利用显微镜物镜的高数值孔径（NA），将激发光聚焦到直径仅几微米的光斑上，首次实现了对微米级微小样品的拉曼光谱采集，为后续共聚焦拉曼成像技术的发展奠定了基础。
成像技术的演进与局限
早期的显微拉曼成像依赖 “拉曼 mapping” 技术：系统通过步进电机驱动的定位平台带动样品移动，逐点采集拉曼光谱，再通过数据处理构建样品的化学成分分布图，其横向分辨率可达几微米。但该技术存在显著缺陷 —— 成像耗时极长。
以 60×60 像素的图谱为例，若单光谱积分时间为 1 秒，仅积分过程就需 3600 秒（1 小时），加上样品定位、CCD 读出及反向扫描的时间，总耗时可轻松翻倍；对于 200×200 像素的图谱，在无积分时间优化的情况下，几乎无法在合理时间内完成采集。因此，缩短单光谱积分时间（目标为 100ms 以下）成为推动拉曼成像实用化的关键需求。
为提升成像速度，研究人员开发了两种非共聚焦的 “multiplex” 技术：
一是“线成像” 技术，通过照明样品上的一条线，并将这条线投影到光谱仪的入口狭缝，利用成像光谱仪使 CCD 的垂直轴记录位置信息、水平轴记录能量色散，可同时采集线沿线的数百个光谱；
二是 “全局成像” 技术，采用均匀照明整个样品的方式，让拉曼光通过可调窄带滤光片后进入成像 CCD，单次曝光即可收集全样品的拉曼光，无需扫描。但这两种技术均存在致命局限 ——不具备共聚焦特性：线成像用狭缝替代针孔，全局成像则完全无针孔，导致系统无法有效抑制荧光背景，空间分辨率和背景抑制效果远逊于共聚焦系统，难以满足复杂样品的分析需求。
共聚焦特性
“共聚焦”（Confocality）的本质是 “共焦点”—— 在光学系统中，样品由点光源照明，同时在探测器前方设置一个针孔，且点光源与针孔严格位于同一焦平面。成像过程中，通过逐点、逐行扫描激光焦点或样品，只有样品焦平面产生的散射光能够聚焦到针孔并被探测器捕捉；而焦平面上方或下方的散射光，因无法在针孔平面聚焦，会被针孔过滤掉，无法进入探测器。这种设计从根本上提升了系统的空间分辨率与背景抑制能力。
共聚焦的关键优势：1. 强效抑制荧光背景
荧光是拉曼光谱分析的主要干扰因素。由于荧光是激发光与样品电子态的共振相互作用，其效率通常比拉曼散射高6个数量级——若样品在所选激发波长下存在荧光，非共聚焦系统的探测器会同时收集焦平面内外的荧光，导致荧光信号完全淹没微弱的拉曼信号，使拉曼分析无法进行。
而共聚焦系统仅收集焦平面的荧光，大幅减少了背景干扰，许多非共聚焦技术无法检测的拉曼图像，在共聚焦系统下可清晰获取。此外，若荧光由样品中的杂质引起，焦平面的高激发强度还能 “漂白” 杂质荧光（即使杂质荧光强度降低），进一步提升拉曼信号的可探测性。
共聚焦的关键优势2：实现3D分析与薄层信号分离
共聚焦系统仅探测焦平面光的特性，使其具备了对透明样品的 3D 结构分析能力——无需切割样品，通过调整焦平面位置，即可获取样品不同深度的拉曼光谱，构建3D化学结构图像。
对于衬底上的薄层样品（如盖玻片上厚度小于1μm的聚合物薄膜），非共聚焦系统因无法区分薄层与衬底的信号，会同时收集衬底（如170μm厚的盖玻片）的强拉曼信号，而薄层的拉曼信号仅为衬底的1/100以下，导致薄层信号被完全掩盖；共聚焦系统则可精准分离薄层（焦平面）与衬底（非焦平面）的信号，实现对极薄样品的有效分析。
共聚焦 VS非共聚焦
与非共聚焦技术相比，共聚焦系统在空间分辨率、背景抑制效果上表现最优，且适用范围更广 —— 无论是透明样品、薄层样品，还是高荧光背景样品，共聚焦系统均能实现高质量分析，而非共聚焦技术仅在特定简单样品场景下有小众的应用。因此，共聚焦拉曼显微镜成为当前拉曼成像领域的主流技术，是复杂样品分析的 “通用解决方案”。
图 1：带有光纤耦合激光源和光谱仪的WITec共聚焦拉曼显微镜系统示意图
拉曼系统吞吐量优化：影响因素与参数选择
“吞吐量” 指系统对拉曼信号的传输与采集效率，直接决定了成像速度与信噪比。要实现高效的共聚焦拉曼成像，需对系统各关键部件进行参数优化，具体影响因素与选择原则如下：
（一）激光波长
激光波长是影响拉曼信号强度、荧光水平与空间分辨率的核心参数，其作用机制与选择逻辑如下：
备注：以德国WITec生产的alpha300 R拉曼显微系统为例，该系统多配备单532nm激光光源。
因此，激光波长的选择需结合样品特性：若样品无明显荧光、需高分辨率与强信号，可选择400-532nm的短波长激光；若样品在短波长下荧光强或易损伤，优先选择 785nm或1064nm的红/近红外激光，并搭配适配波长的高NA物镜。
此外，激光还需满足高斯光束形状（单纵模 TEM00）、线偏振、线宽小于 1cm⁻¹、频率稳定度小于 0.01cm⁻¹、功率波动小于 1-2% 等特性，以保证信号的稳定性与准确性。
（二）激发功率
拉曼信号强度与激发功率成正比，理论上功率越高，信号越强。但激发功率存在严格上限—— 需低于样品因吸收激光能量而发生热分解的阈值，否则会导致样品损伤。
实际应用中，激发功率的典型范围从几微瓦（μW）到数百毫瓦（mW）。例如，对于透明样品，采用绿色激光（如 532nm）激发，焦点直径为 300nm 时，可接受的激发功率通常在 10mW 左右。在实验中，需通过预实验确定最佳功率 —— 在保证信号强度的同时，避免样品损伤。
（三）物镜
物镜是共聚焦拉曼显微镜中决定信号收集效率与空间分辨率的核心部件，其关键参数与选择原则如下：
（四）显微镜吞吐量
显微镜的吞吐量指激发光与拉曼散射光在显微镜内部的传输效率，其优化需关注以下方面：
（五）显微 – 光谱仪耦合
显微镜与光谱仪的耦合效率直接决定了进入光谱仪的拉曼信号量，其优化需关注三个核心需求：
（六）光谱仪吞吐量与光栅
光谱仪是拉曼信号色散与检测的关键环节，其性能优化需关注吞吐量与光栅参数：
图 2：600 线/毫米光栅对500nm非偏振光的一阶反射绝对效率曲线
（七）探测器：从 CCD 到 EMCCD 的技术革新
探测器是拉曼信号检测的 “最后一环”，直接决定了系统的信噪比与成像速度。当前主流的探测器为 CCD（电荷耦合器件），而 EMCCD（电子倍增 CCD）则在快速成像场景下表现出显著优势。
图 3：背照式、背照式深耗尽与标准前照式 CCD 探测器的典型 QE – 波长关系曲线
图 4：背照式 EMCCD 与传统背照式 CCD 在不同读出噪声（4、10、35 电子）下的信噪比 – 每像素光子关系（对应 33kHz、100kHz、2.5MHz 读出速度）
图 5：背照式 EMCCD 相对传统背照式 CCD 的信噪比提升– 每像素光子关系（对应不同读出速度）
应用案例
薄层样品与污染物分析
为验证共聚焦拉曼显微镜的性能，研究人员对玻璃衬底上的超薄 PMMA 薄膜进行了分析：样品为 7.1nm 厚的 PMMA 薄膜（通过旋涂制备，部分区域划伤），表面存在 4.2nm 厚的未知污染层（经 AFM 测厚）。
实验采用 532nm 激光（20mW），搭配 100×NA=0.9 物镜（后续改用 NA=1.4 油浸物镜），采集 200×200 个光谱（扫描范围 50×50μm），积分 PMMA 的 CH 伸缩振动 band（约 3000rel.cm⁻¹）。
图 6：玻璃上 7.1nm PMMA 层在 2950cm⁻¹ 处的共焦拉曼图像（a：背照式 CCD；b、c：EMCCD；d：样品示意图，比例尺 10μm）
实验结果显示：
- 信号分离与成分识别：通过共聚焦系统的背景抑制能力，成功分离了 PMMA 薄膜、污染层与玻璃衬底的信号 —— 将划伤区域（无 PMMA 与污染）的光谱作为纯玻璃光谱，从其他区域的光谱中减去玻璃信号，得到纯 PMMA 与污染层光谱，经分析确认污染层为烷烃（源于样品存储的聚苯乙烯容器脱模剂挥发冷凝）；
- 成像效率与分辨率：采用 EMCCD 探测器（7ms / 谱），总成像时间仅 5.4 分钟，图像空间分辨率达 230nm，清晰呈现了 PMMA 薄膜的划伤区域与烷烃污染层的针状分布；
- 薄层检测能力：即使 PMMA 薄膜厚度仅 7.1nm（拉曼信号强度远低于玻璃衬底），共聚焦系统仍能有效检测，而非共聚焦系统因无法分离衬底信号，完全无法识别该薄层。
图 7：玻璃基底（蓝）、7.1nm PMMA 层（红）与 4.2nm 污染层（绿）的拉曼光谱（左）及共焦拉曼图（右，200×200 光谱，单光谱积分 7ms，总耗时 5.4 分钟）
共聚焦拉曼显微镜作为一种高效的微区分析技术，其核心价值在于共聚焦特性带来的高空间分辨率与强背景抑制能力，以及系统各部件优化后实现的高吞吐量与快速成像。通过合理选择激光波长（如根据样品荧光特性选择红 / 近红外激光）、高 NA 物镜（如 NA=1.4 油浸物镜）、优化的光谱仪与 EMCCD 探测器，可实现对微弱信号、薄层样品、高荧光背景样品的高效分析。
当前，共聚焦拉曼显微镜已在材料科学（如薄膜厚度与成分分析）、生物学（如细胞内分子分布成像）、化学（如催化剂表面反应监测）等领域广泛应用。随着技术的进一步发展 —— 如更高 QE 的探测器、更高效的光学系统、更智能的数据处理算法 —— 共聚焦拉曼显微镜将在更多前沿领域发挥作用，为微观世界的化学分析提供更强大的工具。
参考资料 Raman Instrumentation for Confocal Raman Microscopy
