多光子激光扫描显微镜

作者：孙千 本文转载自公众号：老千和他的朋友们。原文地址：https://mp.weixin.qq.com/s/ST1AcLSSOesSG2z5dS2OZw

与共聚焦显微镜依赖针孔过滤杂光不同，多光子激光扫描显微镜（Multiphoton Laser Scanning Microscopy，简称MPLSM，或多光子显微镜）以非线性光学现象为对比度机制，通过两个或多个光子的联合作用产生样本信号，常见的非线性效应包括双光子激发荧光（TPEF）、二次谐波产生（SHG）、三次谐波产生（THG）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）等。

非线性光学现象的本质，是光在极高强度下与介质的相互作用——在线性光学领域，光不会改变自身颜色，也不会与其他光束相互作用；但在高强度光场中，介质的响应不再呈线性，会产生一系列新的光学效应。

要理解非线性光学，可从原子中电子的经典模型入手。所有物质的原子都包含带正电的原子核和环绕其的电子壳层，价电子因离原子核最远，结合力最弱，最易受光的影响。未受扰动时，价电子处于势能场的最低状态，平衡位置附近的势能可近似为抛物线，电子受到的力遵循胡克定律，呈线性特征（图1蓝线及插图红线）。

图1 电子势能随与原子核距离变化的示意图。插图为平衡位置的放大视图，红点代表电子。

 

当普通强度的光波入射，电子会在平衡位置附近产生微小扰动，运动呈简谐振动，这也是线性光学现象的基础；若入射光的振幅大幅增加，电子的位移会超出抛物线近似范围（图1插图位置 2），此时需要用抛物线势能加三次势能的高阶项来描述原子势能，电子的运动呈现非简谐振动，这便是非线性光学的研究范畴。在这种情况下，光的颜色可能发生改变，二次谐波产生（SHG）就是典型例子 —— 绿色激光入射后，可能产生波长减半的蓝光信号。

最常见的多光子显微镜技术是双光子激发荧光（TPEF）。1931 年，玛丽亚・格佩特–梅耶（Maria Goeppert Mayer）在博士论文中首次从理论上提出双光子吸收的概念，30 年后，凯泽（Kaiser）通过实验观察到这一效应；巧合的是，1961年，弗兰肯（Franken）发表了二次谐波产生（SHG）的首次实验报告。为纪念Goeppert Mayer的贡献，双光子吸收截面的计量单位以她的名字命名，1个格佩特–梅耶（1 GM）定义为10⁻⁵⁰ cm⁴ s photon⁻¹。

上世纪 70 年代中期，谢泼德（Sheppard）及其同事发现，激发光学非线性效应所需的极高强度，仅能在物镜的焦体积内实现，这一发现奠定了多光子显微镜光学切片能力的基础；1990 年，登克（Denk）、斯特里克勒（Strickler）和韦伯（Webb）发明了第一台双光子激光扫描荧光显微镜，此后该技术迅速发展，成为深层组织成像的核心工具。

从量子力学角度看，线性荧光与双光子激发荧光的过程既有相似之处，也存在本质区别。

线性荧光中，电子的能量只能取离散的能级值，最低能级为基态，分子的振动、转动会形成能级亚层（图2 细线）。光入射时，光子携带的能量（E=hνₑₓc）与基态和激发态的能量差（Δₑₓc）相等，电子会在几飞秒内从基态跃迁至激发态（图2b）；几皮秒后，电子通过非辐射弛豫将部分能量传递给转动 – 振动能级，降至激发态最低亚层（图2c）；随后在荧光寿命（皮秒至数纳秒）内，电子返回基态并发射光子，发射光子能量（hνₑₘ）等于激发态最低能级与基态的能量差（Δₑₘ）（图2d）。

图2线性荧光过程的一系列事件。(a) 电子处于基态，入射激发光子；(b) 电子吸收激发光子后，跃迁到转动 – 振动激发态；(c) 电子弛豫到激发态多重态的最低转动 – 振动能级；(d) 电子通过发射频率为 νₑₘ的荧光光子弛豫回基态。

 

双光子激发荧光的初始吸收过程则是吸收两个相同频率的光子，中间涉及虚态（图3虚线），而非真实能态，因此吸收过程瞬时完成（亚飞秒时间尺度）；但电子最终会跃迁至系统的真实激发态，之后通过非辐射弛豫降至激发态最低能级，停留数百皮秒至数微秒后返回基态，发射光子的能量小于两个吸收光子的能量之和，且发射呈360°全方位分布（立体角4π球面度），与二次谐波产生的定向发射截然不同。

图3 二次谐波产生（SHG）和双光子激发荧光（TPEF）过程的一系列事件。左面板：二次谐波产生的发射过程 —— 电子在两个入射光子提供的能量作用下被激发到虚态（注：νₑₘ=2νₑₓc）；右面板：双光子激发荧光的发射过程 —— 其序列与线性荧光相同，但同时吸收两个光子。

 

二次谐波产生（SHG）是多光子显微镜中仅次于 TPEF 的常用技术。这一效应仅在非中心对称材料中存在，无需外部发色团，信号直接来自介质的非线性光学性质，属于内源性成像技术。在生物学领域，SHG 显微镜已广泛用于胶原蛋白成像，近年来也成功应用于微管成像（图4、图5），其对有序结构的探测能力，使其在生物材料和晶体材料研究中具有独特优势。

图4 胶原蛋白和肌球蛋白的二次谐波产生（SHG）成像。(a) 肌腱的图像；(b) 大鼠腓肠肌肌腱连接处的图像。

 

图5 细胞分裂过程中微管的可视化。(a) 分裂中的 HeLa 细胞有丝分裂纺锤体微管的二次谐波产生（SHG）信号；(b) 明场图像（灰色）与二次谐波产生信号（绿色）的叠加图；(c) 刚完成分裂的两个细胞的细胞间桥微管的二次谐波产生信号（绿色）；(d) 不同位置的有丝分裂纺锤体的二次谐波产生信号。

 

非线性现象的激发需要极高的光强度，而这一强度只能通过聚焦激光束实现。光的强度是空间和时间能量密度的度量，单位为每单位面积的瓦特数，与光子能量、入射光子数量直接相关。高功率并不等同于高强度，若能量分布在大面积或长时间内，强度会显著降低。

脉冲激光器的出现解决了这一问题——其脉冲持续时间极短，可将能量高度集中在瞬间。以常用的钛蓝宝石（Ti:Sapp）激光器为例，每秒发射8000万个脉冲，每个脉冲持续时间约100飞秒（1飞秒 = 10⁻¹⁵秒）；将1毫瓦的该激光器通过数值孔径 0.5 的物镜聚焦，焦斑直径约 1 微米，强度可达 7.96×10⁹瓦特/平方厘米，是同功率连续波激光器（6.4×10⁵瓦特 / 平方厘米）的 10,000 倍，足以激发非线性效应。

多光子显微镜的光源主要包括三类：钛蓝宝石激光器、光学参量振荡器（OPO）和光学参量放大器（OPA）。

钛蓝宝石激光器的可调谐范围为 650 至 1080 纳米，脉冲持续时间 10 至 200 飞秒，调谐至 800 纳米时输出功率最高，可达 1 至 3 瓦特；但脉冲持续时间低于 80 飞秒时，因包含多种频率光，易受光学元件折射率影响发生畸变，需进行色散补偿，且可调谐范围会受限。

OPO 和 OPA 并非严格意义上的激光器，其工作原理是非线性相互作用，而非受激辐射，它们以钛蓝宝石激光器的脉冲为 “种子”，可将波长转换并放大，可调谐范围达 300 至 20,000 纳米，能覆盖钛蓝宝石激光器无法企及的光谱区域。不过，这些超短脉冲光源的成本极高，占多光子显微镜总造价的 30% 至 50%，成为该技术普及的主要障碍。

光学切片是多光子显微镜的核心特征，也是其生成高质量三维图像的关键。当使用非线性效应作为对比度机制时，信号仅在焦体积内产生，该焦体积由物镜的横向和轴向分辨率决定，通常仅为几飞升（1飞升 = 10⁻¹⁵升）。

相比之下，线性荧光成像中，激发光在样本内的整个传播路径都会诱导荧光产生，收集到的光来自光的传播路径而非单一光点，导致图像模糊；而多光子显微镜的信号产生被精确局限于特定点，每个像素（或三维成像中的体素）收集的光都能与样本的特定物理点对应，这一特性不仅让三维成像更精准，还能实现三维光学组织学 —— 对大型样本的一个切片成像后，将光强提高到样本烧蚀阈值以上，物理移除已成像切片，重复该过程即可完成完整三维重建。

近红外光（NIR）的使用，让多光子显微镜在深层组织成像中具备了无可比拟的优势。700至1000纳米的近红外光谱区域被称为 “光学窗口”，生物组织在该范围内吸收较低，相对透明——这也是将手指放在强白光光源上时，组织呈现红色的原因；同时，散射强度与光的波长密切相关，长波长光的散射强度比可见光、紫外光低一个数量级。这两种特性共同作用，使激发光的穿透深度大幅增加，文献报道可对深度达1毫米的神经元进行成像，远超共聚焦显微镜的几十微米穿透深度。

此外，近红外光替代了紫外光激发，避免了紫外辐射对细胞和组织的光毒性，可长时间观察样本而不造成损伤；同时，焦体积外的荧光团不会被激发，光漂白现象显著减少，进一步延长了观察时间，这对于活体样本成像尤为重要。

与共聚焦显微镜相比，多光子显微镜的优势十分显著：光漂白程度更低、观察时间更长、光毒性更小、组织穿透更深、背景噪声更少（得益于光学切片能力和散射减少）、信号损失更少（无需针孔过滤，避免了散射光子被阻挡的问题）。

但它也存在明显劣势：超短脉冲激发光源成本高昂、结构复杂，仪器整体价格远高于共聚焦显微镜；在相同操作条件下，其点扩散函数更大，横向分辨率略低于共聚焦显微镜。

此外，两种仪器的结构也存在一些差异：共聚焦显微镜通常使用二极管激光器，多光子显微镜则用超短脉冲激光器或 OPO；多光子显微镜无需激发针孔和检测针孔，简化了设计与校准，但物镜需针对近红外光优化抗反射涂层，反射镜涂层也需替换为近红外光专用类型。

超短激光脉冲的色散补偿是多光子显微镜使用中的关键技术问题。超短脉冲由多种不同频率的光组成，当穿过光学元件时，不同频率光的传播速度不同（低频光速度高于高频光），会导致脉冲在时间上被拉伸，强度降低（图6）。为解决这一问题，需使用压缩器装置：让低频光的传播距离长于高频光，补偿色散效应，确保脉冲到达样本时仍保持短脉冲状态，以维持足够的激发强度。

图6 材料色散导致脉冲拉伸的示意图。入射脉冲由多种频率的光组成，这些光共同传播；在材料内部，低频光的传播速度高于高频光；脉冲离开材料后，会在时间上被拉伸，不同频率的光会在脉冲内的不同时间出现。

 

多光子显微镜光谱学：无损分子鉴定与动态追踪

在生物科学和材料科学领域，研究人员对能精准描述细胞细胞器区室化内源性分子、或封装在生物聚合物基质（如纳米颗粒、微米颗粒）中合成分子的工具需求日益增长。

高效液相色谱（HPLC）是传统的间接分子鉴定和定量方法，但处理步骤复杂，样品前处理、流动相配比等环节的微小误差，都可能导致结果出现较大偏差。多光子显微镜光谱学的出现，提供了一种快速、无损、无创的解决方案 —— 通过光谱指纹（SF）鉴定分子，无需复杂样品处理，能在保持样本完整性的前提下获取分子信息。

光谱指纹是分子的 “光学身份证”，每种分子的光谱指纹都具有唯一性，且在样本中保持稳定。

植物和绿藻的光合组织中，叶绿素是主要的自发荧光色素；人类皮肤和头发的颜色则由棕色真黑素和黄红色褐黑素共同决定，这两种色素的相对比例会随生长阶段、生理状态和环境适应发生变化，因此光谱指纹可作为疾病诊断、生态相互作用研究、代谢组学分析的参考依据。

在植物组织中，多个具有自发荧光的化合物可能共存于同一个细胞，它们的吸收光谱和量子产率（QY）不同，容易导致发射峰重叠，影响鉴定准确性。解决这一问题的关键在于钛蓝宝石激光器的高分辨率调谐能力 —— 可在不同波长下以 1 纳米的分辨率精准调谐，通过改变激发波长并结合解混技术，揭示原本重叠的光谱特征；同时，双光子激发产生的散射更少，三维空间分辨率优异，还能减少光损伤，进一步提升光谱鉴定的准确性。需要注意的是，单光子激发与双光子激发产生的指纹荧光光谱存在差异，实际应用中需根据激发方式调整分析参数。

现代多光子显微镜的高光谱成像通常被称为 Lambda 模式，启用该模式时，显微镜的内部配置会发生特定变化：信号经过收集针孔后，被发送至一个棱镜，棱镜将复合光分散为不同波长的单色光；棱镜后方是安装在平移台上的电动狭缝，狭缝孔径决定透射的光谱带宽，平移台则用于将狭缝对准目标波长；选定带宽和中心波长后，信号被传送至多通道光电倍增管（通常由 32 个元件组成），该装置本质上是一个光谱仪，能在 350 至 750 纳米的可见光区域，以 1、5、10 纳米的带宽步长记录信号。

另一种配置是在棱镜后直接使用多通道检测器，无需电动狭缝，适用于快速光谱采集。通过选择合适的参数，可分离含有多种荧光团的样本产生的荧光（前提是各荧光团发射光谱不同），利用光谱信息解混光谱通道，构建多光谱通道图像，且不会限制图像采集效率。

高光谱成像的应用场景十分广泛。在淡水生态系统研究中，可通过该技术分析藻类群落与细菌的共生关系：绿藻的叶绿素光谱主要集中在 613 至 713 纳米，细菌群落的光谱则集中在 413 至 433 纳米的蓝光区域，通过解混通道可清晰区分二者的分布（图7a-f）。

图7 多光子显微镜的 Lambda 模式分析。(a) 藻类群落的荧光图像；(b) 对应叶绿素色素的光谱曲线；(c) 解混通道后的原始图像，显示恢复的图像；(d) 相比之下，细菌群落在蓝光区域显示荧光；(e) 光谱图显示发射峰位于可见光的蓝光区域；(f) 解混通道的原始图像，显示恢复的数据。

 

在纳米技术领域，罗丹明 B（rhodamine B）和曙红 Y（eosin Y）等荧光染料，在双光子激发下的本征光谱曲线稳定，即使暴露于不同环境条件也不会发生显著变化，常被用于标记纳米颗粒；将这些标记后的纳米颗粒施用于植物和动物，可追踪其在细胞中的动态分布 —— 例如，用罗丹明 B 标记的纳米颗粒施用于玉米（Zea mays）幼苗后，多光子显微镜能清晰观察到纳米颗粒从水介质进入根髓的内化过程，以及在生物体组织深处的积累情况（图8a）。

图8 多光子显微镜中通过 Lambda 模式表征多种染料的光谱。(a) 罗丹明 B（rhodamine B）和曙红 Y（eosin Y）的光谱曲线；(b) 罗丹明 B 染色的图像；(c) 曙红 Y 染色的图像；(d) 用罗丹明 B 染色的纳米颗粒标记的玉米幼苗图像；(e) 根部维管柱的特写图像；(f) 显示根中柱的图像 —— 纳米颗粒不可见，它们被限制在凯氏带和内皮层之间。

 

共聚焦显微镜 VS多光子显微镜

共聚焦显微镜与多光子显微镜均基于激光扫描技术，是光学成像领域的里程碑式创新。

共聚焦显微镜以针孔共焦设计为核心，通过精准过滤离焦光，结合连续波激光、PMT 检测器和多种荧光染料，实现了表面和浅层样本的高分辨率三维成像，横向分辨率可达 180-200 纳米，在细胞表面结构、细胞器形态观察中具有不可替代的优势，但受限于光漂白和穿透深度，且需依赖外部染料标记。

多光子显微镜则借助非线性光学现象，以超短脉冲近红外激光为激发源，无需针孔设计，在深层组织成像（可达1毫米）、长时间活体观察和内源性信号检测方面表现突出，光毒性和光漂白显著降低，其光谱学应用更拓展了无损分子鉴定与动态追踪的边界，但仪器成本高昂，技术门槛较高。

两种技术各有侧重、互补共生，它们的出现极大地推动了生物医学、材料科学等领域的发展——从细胞内细胞器的精细结构观察，到深层组织的三维重建，从分子水平的光谱鉴定，到纳米颗粒的体内追踪，为科研人员提供了前所未有的微观视角，成为探索生命奥秘和材料特性的强大工具。随着光学组件、光源技术和信号处理算法的不断进步，这两种显微镜的性能将持续提升，应用场景也将进一步拓展，为相关学科的发展注入新的动力。

参考资料

1 Confocal and Multiphoton Microscopy

2 Multiphoton Microscopy | Edmund Optics

3 Molecular Expressions Microscopy Primer: Specialized Microscopy Techniques – Fluorescence – Multiphoton Introduction