作者：孙千 本文转载自公众号：老千和他的朋友们。原文地址：https://mp.weixin.qq.com/s/TX5pZgg2m6HSRrMhiAX8Hg
对于透射电镜（TEM）技术员而言，日常工作中最棘手的挑战莫过于束敏感样品的成像——生物切片、软材料、钙钛矿这类样品，稍高的电子剂量就会导致结构坍塌，可剂量太低又无法获取清晰的相位信息。
长期以来，泽尼克相差法（ZPC）一直是 TEM 技术员处理这类样品的标配方案，但实际操作中，低剂量下成像模糊、电子剂量莫名浪费的问题始终困扰着一线工作者。
泽尼克相差法（ZPC）的原理：相干电子波照射样品后，会分裂为穿透样品的直射波（低频成分）和被散射的衍射波（高频成分）。在物镜后焦平面放置泽尼克相位板（ZPP），仅对直射波施加 π/2 的相位偏移，让两束波形成固定相位差，最终在像平面干涉叠加，把原本无法直接探测的相位差异，转化为清晰的明暗对比图像。
Francisco Vega Ibáñez和Jo Verbeeck团队的研究给出了明确答案，通过数值模拟验证了随机相位照明（RPI）衍射法的显著优势，不仅点破了 ZPC的归一化 “坑点”，更实现了5倍剂量效率提升，对TEM 技术员的日常实操和样品保护极具指导意义。
一、实操痛点与实验设计：技术员核心需求
TEM 技术员在处理低密度、束敏感样品时早已发现，仪器分辨率早已不是瓶颈，真正制约成像质量的是束损伤。电子剂量稍高，样品结构就会不可逆损坏；剂量过低，相位信息又难以提取，这种两难局面让不少珍贵样品白白损耗。
传统 ZPC 虽然操作简便，但其实际剂量利用率一直不尽如人意，TEM 技术员却苦于没有更优的替代方案。该研究正是针对这一实操痛点，通过对比两种可直接落地的成像方案，为 TEM 技术员提供了清晰的参数优化方向和操作思路。
研究将实验过程简化为 “用最少电子获取最准相位信息” 的日常场景，对比了 TEM 技术员熟悉的 ZPC 与创新的 RPI 衍射法。
ZPC的核心操作是在物镜后焦平面放置相位板，将低频成分偏移 π/2 后直接成像，无需复杂后处理，上手简单，但实际使用中 TEM 技术员常感觉剂量不够用；而 RPI 衍射法需要在衍射平面记录强度，预设多组随机照明模式，再通过软件逆推相位，虽然多了几步设置，但剂量利用效率大幅提升。
值得一提的是，研究特意避开了复杂的理论推导，聚焦 TEM 技术员最关心的电子剂量分配、参数设置、成像效率等实操问题，实验装置示意图（图 1）也清晰展示了两种方案的核心差异，易于 TEM 技术员理解和借鉴。
图 1 实验装置示意图。目的是通过相干电子波照射未知物体，并利用由 M 个独立像素组成的理想探测器检测电子到达情况，以测量物体的 N 个相位。左侧装置为理想泽尼克相位板（ZPP）配置，右侧装置描述了在衍射平面中使用可编程输入波的探测方式。研究将对比两种装置在不同实验电子剂量下的相位估计误差，实操中 TEM 技术员可根据样品类型灵活选择配置，束敏感样品优先考虑右侧 RPI 方案。
二、关键参数与算法实操：落地的优化方案
（一）ZPC 的 “归一化坑点”
TEM 技术员日常使用 ZPC 时，常遇到 “低剂量下成像模糊，调高剂量也没明显改善” 的情况，研究发现问题根源在于归一化参数设置的误区。此前，行业内普遍默认把归一化参数 C 设为 1，却未意识到这一设置会导致照明区域内的低频信息丢失，而且需要利用视场外部的电子形成参考波 —— 这不仅浪费大量电子剂量，还可能损伤样品的非目标区域，后续想复用这些区域都无法实现。
经研究验证，C=1/2 才是实操中的最优值，该数值能在不产生额外参考波的前提下，完整恢复照明区域内的所有空间频率，相位误差标准差比传统的 C=1 设置低√10≈3.16 倍，成像精度直接提升一个档次。
这里有个重要的实操提醒：TEM 技术员设置 ZPC 参数时，一定要让相位板宽度与照明束斑尺寸匹配，否则即便调对了C值，也会出现剂量浪费和信息丢失的问题，不少一线技术员都曾在这一细节上吃亏。
（二）RPI 衍射法的实操核心
部分 TEM 技术员可能认为 RPI 衍射法需要设置多组照明模式，操作起来会很复杂，但实际熟悉后会发现其逻辑清晰，且软件算法已能满足日常使用需求。照明模式设置方面，研究建议选择 NRPI≥2 组随机相位照明，日常默认 16 组即可，每组照明相位服从 0 至 π 的均匀分布，收敛效果最好；若想尝试其他模式，比如每组仅单个像素的相位在−π/2 至 +π/2 之间随机变化，或者采用阿达马基集，实操效果也相近，无需过分纠结。
算法选择上，TEM 技术员日常批量处理样品时，优先选用格尔希伯格 – 萨克斯顿（GS）算法，其计算速度快，且相位误差与精准的最大似然（ML）算法高度吻合，完全能满足 64×64 像素这类实际尺寸样品的处理需求；如果是开展单颗粒分析这类对精度要求极高的实验，再选用 ML 算法，虽然耗时久一点，但能逼近最佳精度上限（即克拉美–罗下界 CRLB），实操中还能通过 CRLB 判断成像效果是否达标。
具体操作步骤也较为简便：先初始化样品相位猜测值，振幅设为 1，相位在 ±π 之间随机分布；再按预设的照明模式照射样品，记录衍射强度；随后让软件迭代施加衍射约束，再反向传播至实空间；最后对多组照明结果取平均，减少伪影，即可输出清晰的相位图像，整个流程与 TEM 技术员日常处理常规样品的思路大同小异。
三、数值实验结果：指导日常样品成像
研究的三组数值实验结果，完全对应 TEM 技术员日常遇到的不同样品场景，实操参考价值极高。
首先是一维实验（4 个相位值），处理薄膜切片这类简单结构样品时，低剂量下（Ne<10⁴）ZPC 与 RPI 性能相近，TEM 技术员可任意选择；但电子剂量超过 10⁴后，ZPC 会因为公式线性化极限出现系统误差，成像开始模糊，此时换成 RPI 就能稳定出图（图 2）。而且实验还验证了 GS-RPI 与 ML-RPI 性能几乎一致，TEM 技术员日常工作用 GS 算法完全够用，无需浪费时间在复杂算法上。
图 2 平均均方根（RMS）相位误差随总电子剂量变化的数值模拟。该物体为随机相位物体，含 4 个未知相位值，相位范围限制在 ±π/10 以内，这也是 TEM 技术员判断弱相位物体的实操标准。对于每个电子剂量，研究使用不同的随机物体重复模拟 100 次，随机相位照明（RPI）采用 16 种固定的随机照明模式。实操参考明确：电子剂量约为 Ne=10⁴之前，两种方法均可选用；超过该剂量，优先用 RPI 避免系统误差；GS-RPI 与 ML-RPI 性能接近，日常工作中 TEM 技术员用 GS 算法即可满足需求。
处理病毒颗粒、纳米晶体这类小尺寸、高敏感样品时，RPI 的优势更为明显，小型二维实验（4×4 像素）结果显示，其剂量效率比 ZPC 高 5 倍，这意味着相同成像质量下，RPI 所需的电子剂量仅为 ZPC 的 1/5，能极大减少样品损伤（图 3）。此前，TEM 技术员处理珍贵的病毒样品时，常担心剂量不够导致成像模糊，剂量太高又会损坏样品，如今 RPI 方案的出现，让这一难题迎刃而解。
图 3 4×4 相位物体的数值模拟。每个电子剂量下，物体包含 100 种不同的随机相位噪声实现，相位范围为 ±π/10。电子剂量均匀分配至 16 种随机相位照明模式。实操提醒：由于归一化修正，ZPC与RPI 的结果差异显著；TEM 技术员处理小尺寸束敏感样品时，优先选用 RPI，既能保护样品不被过量电子损伤，又能快速获得清晰的相位图，效率大幅提升。
TEM 技术员日常处理的生物切片、聚合物薄膜等多数样品，尺寸都接近 64×64 像素，这类样品的成像关键技巧在实际二维实验结果中体现得十分清楚（图 4）。低剂量时（Ne<10⁶），ZPC 和 RPI 都会出现误差平台期，需要特别注意的是，这并非成像变好，而是相位截断或包裹导致的伪影，TEM 技术员一定要避开这个剂量区间；如果确实需要低剂量成像，RPI 建议选 NRPI=2，避免每组照明剂量过低影响效果；高剂量下，RPI 的相位误差比 ZPC 低√5 倍，而且没有 ZPC 的剂量浪费问题，批量成像时优先选 RPI 准没错。
图 4 64×64 随机相位物体的均方根（RMS）相位误差（相位范围为 π/10），采用 NRPI=2、16、64 种照明模式。实操要点明确：一是低剂量时（Ne<10⁶），ZPC 和 RPI 均会出现误差平台期，这是伪影而非优质成像，需避开该剂量区间；二是低剂量成像时，RPI 建议选 NRPI=2，确保每组照明有足够剂量；三是高剂量下，RPI 相位误差比 ZPC 低√5 倍，且无剂量浪费，TEM 技术员批量成像时优先选用 RPI。
“摄影师” 物体的成像对比（图 5）更直观地展示了两种方案的实操差异：ZPC 的有效剂量仅占 5/8，其余 3/8 都浪费在照明区域外（图 6），而 RPI 的剂量全用于有效成像，低剂量下也能保留更多样品细节。这对 TEM 技术员处理稀有生物样本、新型材料样品这类珍贵样品来说至关重要，每一丝剂量都需用在刀刃上，避免不必要的浪费和损伤。
图 5 泽尼克相差法（ZPC）与格尔希伯格 – 萨克斯顿（GS）– 随机相位照明（RPI）在更接近实际的二维物体上的相位恢复对比（随剂量变化）。高剂量下，两种方法均能有效恢复物体。上排标记为⋆的图像未遵循色标缩放，以辅助可视化。实操观察：低剂量下 ZPC 未探测到电子的区域呈平坦相位，没有任何有效信息；RPI 虽有轻微相位包裹，但仍能识别物体轮廓，更适合低剂量保样成像，尤其适合 TEM 技术员处理珍贵样品。
图 6 64×64 随机相位物体的正确采样泽尼克相差法（ZPC）图像示例（零填充至 128×128，Ne=5×10⁵）。中心 64×64 区域包含实际的相位相关图像，占物体照明总剂量的 5/8；其余 3/8 的剂量落在中心区域之外，未提供任何有用信息。实操警示：ZPC 的剂量浪费问题是客观存在的，TEM 技术员处理稀缺、不可再生的样品时，一定要谨慎选择，能不用就不用，优先考虑 RPI 方案。
四、实操难点与解决方案
研究也指出了两种方法的实操难点，结合 TEM 技术员的日常工作经验，可整理出一套切实可行的应对方案。先看 ZPC，其核心问题集中在相位板精度和尺寸匹配上。理想的艾里斑状泽尼克相位分布很难实现，而且实际相位偏移可能偏离 π/2，这就需要 TEM 技术员定期校准相位板，用已知相位的薄膜作为标准样品验证偏移精度，发现偏差及时调整；另外，照明束斑大小变化时，相位板宽度要同步调整，否则会丢失低频信息，TEM 技术员可建立一份束斑尺寸– 相位板宽度对应表，更换样品或调整束斑后直接查表设置，无需每次都重新摸索。
再看 RPI，其主要问题是可编程相位板的填充因子限制，实际使用中会引入振幅调制，导致照明不均匀。解决这一问题的办法较为简便，采用叠层成像方式扫描探针，让探针位置适度重叠，就能确保样品所有区域都能被均匀照明；还有个常见问题是多组照明过程中样品容易出现污染或漂移，影响成像一致性，TEM 技术员可在成像前对样品进行等离子清洗，减少污染，同时启用样品台稳定系统，在每组照明间隔内进行漂移校正，保证成像质量稳定。
剂量分配方面，研究也有几个实操技巧可供 TEM 技术员参考：一是遵循 “1/√(Ne/N)” 趋势，电子剂量与相位误差成反比，实操中可根据样品能承受的最大剂量，结合这一趋势估算最佳成像效果；二是务必避开低剂量平台期，通过预实验确定样品的 “安全剂量区间”，既不浪费剂量，也避免伪影影响结果；三是处理珍贵样品时优先用 RPI，相同成像质量下能减少 80% 的电子剂量，极大降低样品损伤风险。
五、重新定义低剂量成像方案
对 TEM 技术员而言，这项研究的价值不在于复杂的理论推导，而在于提供了可直接落地的优化方案，改变了行业对低剂量成像的认知。此前，TEM 技术员普遍认为 ZPC 是低剂量成像的 “终极方案”，如今研究证实，ZPC 的归一化参数设置错误导致了剂量浪费，即便修正参数后，其性能仍不及 RPI 衍射法。
日常工作中，TEM 技术员可根据样品类型灵活选择方案：处理束敏感样品，尤其是珍贵、不可再生的样品时，优先选用 RPI 衍射法，5 倍剂量效率提升能显著保护样品，而且 GS 算法的快速性完全满足日常批量成像需求；如果是常规筛查样品，对操作简便性要求高，可选用修正参数（C=1/2）后的 ZPC，但要接受它剂量浪费的短板。
更值得期待的是，RPI 衍射法无需复杂的投影系统和图像校正器，未来可能发展出小型化、低成本的桌面式 TEM，专门用于束敏感样品成像，这会大大简化 TEM 技术员的操作流程，降低实验门槛。
总而言之，这项研究为 TEM 技术员提供了 “少用电子、多拿信息、保护样品” 的实操路径 —— 调整 ZPC 的归一化参数能立竿见影提升效果，而 RPI 衍射法则为高要求样品成像提供了更优选择。在日常工作中，TEM 技术员可根据样品的束敏感程度、尺寸大小和珍贵程度灵活选用方案，在保护样品的同时，获得更精准的相位信息，让每一次 TEM 实验都能发挥最大价值。
参考资料 Retrieval of Phase Information from Low-Dose Electron Microscopy Experiments: Are We at the Limit Yet?
