作者：孙千 本文转载自公众号：老千和他的朋友们。原文地址：https://mp.weixin.qq.com/s/w7FKzM302aBz2qDTVdUkYA
场发射扫描电镜（FE-SEM）能实现≤1 nm的高分辨率成像，是观察生物组织精细结构的重要工具。但生物组织本身导电性差，在FE-SEM观测中容易产生成像假象，因此需要在样品表面镀一层薄的导电膜层，这一步也是FE-SEM样品前处理的关键。
铂（Pt）是传统扫描电镜（SEM）和冷冻断裂实验中常用的膜层材料，近些年铬（Cr）因为膜层颗粒极细、分布均匀，成为了FE-SEM样品膜层的热门选择，而金钯合金（Au/Pd）膜层的实际性能还没有被系统验证过。
为了弄清楚Au/Pd膜层能否替代Pt和Cr，用于生物组织的FE-SEM观测，荷兰格罗宁根大学细胞生物学与电镜实验室I. STOKROOS等人，以1.5~3.0 nm厚的Au/Pd、Pt、Cr为研究对象，用不同厂商的平面磁控溅射镀膜仪制备膜层，再通过FE-SEM和TEM观察膜层的颗粒尺寸、形状、密度和分布，系统对比了三种膜层的性能差异及影响因素，相关研究结果发表在1998年《Journal of Microscopy》上。
一、实验材料与方法
（一）实验基底与膜层材料
实验选择高真空蒸发沉积在新鲜解理云母片上的碳膜作为膜层基底，再将碳膜固定在3 mm的TEM铜网上。之所以选这个基底，是因为生物样品成分复杂、表面不平整，会干扰金属膜层的沉积，而碳膜基底成分单一、表面平整，能排除这些干扰，让实验只聚焦膜层本身的性能。
膜层材料选用Au/Pd、Pt、Cr三种纯金属，同时加入Pt/C复合膜层做参考；膜层厚度控制在1.5~3.0 nm，这一厚度区别于≤1.0 nm的超薄膜层，不需要极端严苛的制备条件，更适合生物样品的常规观测。
（二）观测与制备仪器
1. 观测仪器：用冷场发射扫描电镜（工作电压5 kV/15 kV、工作距离6 mm、束流10⁻¹¹ A）和透射电镜（钨灯丝、工作电压100/120 kV，调至高分辨率模式），精准观察膜层的微观结构。
2. 制备仪器：使用多套膜层制备设备，包括Balzers BAE 120高真空蒸发仪、Ion Tech B370离子束溅射仪，以及Denton、Cressington 208 HR、Fisons、Xenosput XE200四款平面磁控溅射仪，所有设备均按照厂商设定的标准参数操作，参数差异主要体现在源–基底距离、溅射电流、电压和氩气压力上。
（三）膜层厚度测量与稳定性验证
膜层厚度通过仪器配套表格测算，参考指标为靶–基底距离、电流和溅射时间。研究人员将该方法的测量结果与薄膜监测仪的结果对比，发现相对误差为20~22%，这一误差范围能满足膜层之间的对比研究要求。
为了验证膜层是否稳定，研究人员分别在膜层沉积后立即观测，以及沉积1周后再次观测，结果发现膜层结构没有发生任何变化，说明膜层在短期内稳定性良好。
二、实验结果
研究先以离子束溅射制备的Au/Pd膜层为对照，再分析不同平面磁控溅射设备制备的Au/Pd、Pt、Cr膜层特征，最后验证三种膜层在颗粒和低温生物样品表面的沉积效果，各实验组的膜层结构都能通过电镜图像直观看到，核心数据汇总在表1中。
* 颗粒覆盖面积与测量总面积的比值；†，膜层颗粒（核）的平均面积；‡标注“高”表示该涂层的颗粒尺寸差异较大；FE-SEM/TEM 下的视觉光滑程度。
（一）离子束溅射Au/Pd膜层的结构特征
用Ion Tech B370离子束溅射仪制备3.0 nm厚的Au/Pd膜层，其颗粒尺寸比同厚度的纯Au膜层小。在FE-SEM下能看到膜层颗粒的细微结构，TEM下则能看到颗粒堆积得比较紧密，形状不均匀，大颗粒之间还分布着细小颗粒，膜层整体接近连续状态（图1）。这一膜层为后续磁控溅射Au/Pd膜层的性能对比提供了基础参考。
图 1离子束溅射（Ion Tech B370 型设备）制备的3.0 nm 金钯（Au/Pd）涂层，沉积于常温碳膜基底；场发射扫描电镜（a）与透射电镜（b）成像。可见尺寸较小的金钯颗粒核，形成近乎连续的涂层。标尺=50 nm（见图4）。
（二）平面磁控溅射Au/Pd膜层的结构特征
用三款不同的磁控溅射仪制备1.5 nm厚的Au/Pd膜层，其颗粒尺寸都比离子束溅射的3.0 nm Au/Pd膜层小，且不同设备制备的膜层，颗粒形态和分布各有特点：
Cressington 208 HR制备的膜层，FE-SEM下看不到颗粒的细微结构，TEM下颗粒接近球形、大小不均，图像背景呈灰色，说明背景中还有更细小的颗粒，整体颗粒分布均匀且紧密团聚（图2）；
图 2平面磁控溅射（Cressington 208 HR 型设备）制备的 1.5 nm 金钯涂层，沉积于常温碳膜基底；15 kV 场发射扫描电镜（a）与 100 kV 透射电镜（b）成像。可见扫描电镜下的成像对比度相较于金涂层略低；多数球形颗粒核团聚形成紧密排列的聚集体。标尺=50 nm（见图4）。
Denton设备（牛津CT 1500HF冷冻转移系统配套）在-120℃下制备的膜层，FE-SEM下无明显颗粒细微结构，TEM下颗粒呈异质弯曲状、堆积得非常紧密，颗粒之间的间隙极小，形成了连续的膜层（图3）；
图 3平面磁控溅射（登顿–牛津 CT 1500HF 冷冻转移系统）制备的 1.5 nm 金钯涂层，沉积于 – 120℃碳膜基底；15 kV 场发射扫描电镜（a）与 100 kV 透射电镜（b）成像。可见尺寸极小的金钯颗粒核形成连续的涂层。标尺=50 nm（见图4）。
Xenosput XE200制备的膜层，FE-SEM下看起来没有明显结构，TEM下颗粒呈星状、尺寸均匀，颗粒间间隙较大，但背景由致密堆积的细小颗粒填充，膜层整体还能看到六边形的颗粒排列规律（图4）。
图 4平面磁控溅射（Xenosput XE200 型设备）制备的1.5 nm 金钯涂层，沉积于常温碳膜基底；15 kV 场发射扫描电镜（a）与透射电镜（b）成像。可见形态不规则的颗粒核排列密度适中且相互靠近。标尺 = 50 nm。
（三）平面磁控溅射Pt膜层的结构特征
用Fisons、VG Microtech SC 7640、Denton、Cressington 208 HR四款设备制备1.0~2.0 nm厚的Pt膜层，发现其结构受基底温度和溅射电压影响特别显著，也是三种纯金属膜层中，颗粒形态差异最大的一种：
Fisons设备在-120℃下制备的2.0 nm Pt膜层，FE-SEM下能看到细微结构，颗粒团聚体的尺寸比离子束溅射的Au/Pd膜层大；TEM下颗粒呈角形、尺寸均匀，团聚体之间有较大间隙（图5）。而在常温下用该设备制备的同厚度Pt膜层，颗粒尺寸更大、团聚更明显，还出现了柱状结构，膜层的连续性变差（图6）；
图 6平面磁控溅射（菲森斯 – 500 型设备）制备的 2.0 nm 铂涂层，沉积于常温碳膜基底；15 kV 场发射扫描电镜（a）与 100 kV 透射电镜（b）成像。颗粒聚集体尺寸更大；透射电镜下可见涂层堆积密度显著降低。标尺（见图 10）=50 nm。
VG Microtech SC 7640设备在1.2 kV电压下制备的2.0 nm Pt膜层，FE-SEM下能看到球状结构，TEM下颗粒接近球形或长条形，堆积紧密（图7）；在800 V电压下制备的1.0 nm Pt膜层，FE-SEM下几乎看不到细微结构，TEM下颗粒呈角形、尺寸更小，背景发灰，说明存在细小颗粒（图8）。目前还无法确定，是膜层更薄还是溅射电压更低，导致了颗粒尺寸变小；
图 7平面磁控溅射（VG Microtec SC 7640 Polaron 型设备）制备的 2.0 nm 铂涂层，1.2 kV 下沉积于常温碳膜基底。场发射扫描电镜（a）中可见尺寸较大的铂结构；透射电镜下可见颗粒（或聚集体）尺寸偏小、形态均一且排列紧密。标尺（见图 10）=50 nm。
图 8平面磁控溅射（VG Microtec SC 7640 Polaron 型设备）制备的 1.0 nm 铂涂层，制备条件同图 7，800 V 下沉积于常温碳膜基底。15 kV 场发射扫描电镜成像近乎无明显结构；100 kV 透射电镜下可见尺寸极小、形态高度均一的铂颗粒核。标尺（见图 10）=50 nm。
Denton设备在常温下制备的2.0 nm Pt膜层，FE-SEM下看不到精细结构，TEM下颗粒有球形也有长条形，堆积紧密，对基底的填充效果较好（图9）；
图 9平面磁控溅射（登顿 – 牛津 CT 1500HF 冷冻转移系统）制备的 2.0 nm 铂涂层，沉积于常温碳膜基底。15 kV 场发射扫描电镜下几乎无精细结构可见；透射电镜下可见铂颗粒核紧密堆积，部分颗粒存在高度差异（对比图 8）。标尺（见图 10）=50 nm。
Cressington 208 HR设备在常温下制备的1.5 nm Pt膜层，FE-SEM下完全看不到细微结构，TEM下颗粒呈微角形且边缘圆润，是所有Pt膜层中颗粒尺寸最小的，背景发灰说明存在无法被该TEM分辨的超小颗粒（图10）。
图 10平面磁控溅射（Cressington 208 HR 型设备）制备的 1.5 nm 铂涂层，沉积于常温碳膜基底。15 kV 场发射扫描电镜下几乎无精细结构可见；透射电镜下可见铂颗粒核紧密堆积，部分颗粒存在高度差异（对比图 8）。标尺 = 50 nm。
（四）平面磁控溅射Cr膜层的结构特征
用Cressington 208 HR和Xenosput XE200两款设备制备1.5 nm厚的Cr膜层，这是三种纯金属膜层中颗粒尺寸最小的，且两款设备制备的Cr膜层都形成了连续、平整的无定形层。
Cressington 208 HR制备的Cr膜层，FE-SEM下无细微结构，外观和Denton设备制备的Au/Pd膜层相近；TEM下颗粒尺寸均匀、堆积紧密，因为Cr的原子序数低，成像的对比度明显低于Au/Pd和Pt膜层（图11）；
图 11平面磁控溅射（Cressington 208 型设备）制备的 1.5 nm 铬（Cr）涂层，沉积于碳膜基底；15 kV 场发射扫描电镜（a）与 100 kV 透射电镜（b）成像。可见尺寸极小的铬颗粒核形成连续平整的涂层。标尺（见图 12）=50 nm。
Xenosput XE200制备的Cr膜层，FE-SEM和TEM下都呈平整的无结构状态，近距离观察能看到精细的颗粒分组特征，后续验证发现，这一特征是由碳膜基底本身的细微结构导致的，并非膜层自身的特性（图12）。
图 12平面磁控溅射（爱德华 XE200 Xenosput 型设备）制备的 1.5 nm 铬涂层，沉积于碳膜基底；15 kV 场发射扫描电镜（a）与 100 kV 透射电镜（b）成像。涂层为超光滑的连续平整层。标尺 = 50 nm。
（五）乳胶与低温生物表面的膜层沉积效果
为了验证膜层在实际样品表面的使用效果，研究人员将Pt/C、Cr、Au/Pd膜层分别沉积在乳胶颗粒和酵母冷冻断裂面上，结果如下：
用Balzers BAE 120设备制备的2.0 nm Pt/C复合膜层，沉积在乳胶颗粒表面后，其Pt颗粒尺寸比所有纯Pt膜层都小，也是本次研究中颗粒尺寸最小的膜层（图13）；
图 13高真空蒸发（巴尔泽斯 BAE 120 型设备）制备的 2.0 nm 铂涂层，采用阴影镀膜法沉积于碳膜基底的乳胶颗粒表面；15 kV 场发射扫描电镜（a）与 100 kV 透射电镜（b）成像。标尺：（a）=100 nm，（b）=50 nm。
用Xenosput XE200设备制备的1.5 nm Cr膜层，沉积在乳胶颗粒表面后，形成了光滑、连续的膜层，FE-SEM下看不到明显的细微结构。
用Denton设备在-120℃下制备的1.5 nm Au/Pd膜层，沉积在液氮速冻的酵母冷冻断裂面上后，FE-SEM下能清晰看到酵母的膜内褶和膜颗粒结构，没有出现制备过程或电子束辐照导致的成像假象（图15），这说明Au/Pd膜层非常适合低温生物样品的FE-SEM观测。
图 14平面磁控溅射（爱德华 XE200 Xenosput 型设备）制备的 1.5 nm 铬涂层，沉积于碳膜基底的乳胶颗粒表面；15 kV 场发射扫描电镜成像。可见涂层表面十分光滑，无明显的亚结构。标尺 = 100 nm。
图 15平面磁控溅射（登顿 – 牛津 CT 1500HF 冷冻转移系统）制备的 1.5 nm 金钯涂层，-120℃下沉积于酵母细胞断裂面，成像可见膜颗粒结构。标尺 = 100 nm。
三、实验讨论
本次研究的核心目的，是验证Au/Pd膜层能否用于放大倍数≤200000×（底片倍数）的生物组织FE-SEM观测。通过与Pt、Cr膜层的系统对比，研究人员明确了三种膜层的优劣势、影响膜层结构的关键因素，以及不同膜层的适用场景。
（一）Au/Pd、Pt、Cr三种膜层的性能对比
这里先解释一个关键指标：二次电子产率，即膜层在电子束照射下能产生的二次电子数量，数量越高，FE-SEM的成像对比度越好，样品结构看得越清晰。
1. Cr膜层：最大优势是颗粒尺寸极小、膜层连续性好，适合超高分辨率的膜结构研究和X射线微分析，因为它不会干扰生物样品中磷、钙等元素的检测信号。但缺点也很突出：二次电子产率远低于Au/Pd和Pt，成像对比度差；膜层表面容易快速氧化，需要一直放在真空环境中储存；制备时对Cr靶纯度、真空度和氩气纯度要求极高，操作难度大。
2. Pt膜层：是传统高分辨率电镜观测的常用材料，但颗粒特别容易团聚，且团聚程度受温度和电压影响大：低温能抑制团聚，让颗粒更小、膜层更致密，常温下则容易形成柱状结构，降低膜层连续性；溅射电压越低，颗粒尺寸越小，膜层结构越均匀。另外，Pt/C复合膜层能进一步减小颗粒尺寸，但制备工艺更复杂。
3. Au/Pd膜层：是本次研究中综合性能最好的膜层。核心优势是二次电子产率远高于Pt和Cr，在FE-SEM下，同厚度的Au/Pd和Pt膜层，成像对比度、颗粒尺寸几乎没有差异；且Au/Pd的颗粒核很小，不会向横向或纵向明显生长，不会遮盖生物样品的表面精细结构。同时，Au/Pd膜层不会氧化，对制备设备的要求比Cr膜层低，低温下还能形成连续膜层，适配生物样品的冷冻制备工艺。
（二）影响膜层结构的关键因素
1.溅射设备构造：这是决定同种金属、同厚度膜层性能的核心因素。设备的源–基底距离、真空腔设计、靶材形状等，会直接影响金属颗粒的沉积方式和分布，哪怕是1.5 nm的Au/Pd膜层，用不同磁控溅射仪制备，颗粒形态、堆积密度也会相差很大。
2. 基底温度：低温（-120℃）能减缓金属核的生长和颗粒团聚，让膜层更致密，这一结论和之前的相关研究一致。而且低温实验中，真空环境不会被打破，进一步减少了颗粒团聚的可能。
3. 溅射工艺参数：溅射电压主要影响Pt膜层的颗粒尺寸，氩气纯度和真空度则是Cr膜层制备的关键；膜层厚度增加时，金属颗粒会同时向横向和纵向生长，颗粒尺寸变大。
4. 基底效应：碳膜基底自身的细微结构，会在FE-SEM和TEM成像中形成微弱的图案，这个图案不是膜层本身的特征，不会影响对膜层性能的判断。
（三）不同膜层的实际应用场景
结合三种膜层的性能特点，能清晰划分它们的适用场景：
1. Cr膜层：适合超高分辨率STEM/FE-SEM的膜结构研究，以及生物样品的X射线微区分析；
2. Pt膜层：适合传统常温非生物样品的SEM观测，Pt/C复合膜层则可用于对颗粒尺寸要求极高的超高分辨率研究；
3. Au/Pd膜层：适合生物组织，尤其是低温冷冻断裂样品的常规FE-SEM观测（≤200000×），是生物样品观测中Pt和Cr膜层的优质替代。
此外，研究还发现，磁控溅射设备比离子束溅射设备更适合制备生物样品膜层：磁控溅射能减少膜层颗粒与惰性气体分子的碰撞，降低阴影效应，即使不旋转样品，也能制备出均匀的膜层，更适合生物样品的批量前处理。
四、实验结论
本次研究通过系统对比平面磁控溅射制备的1.5~3.0 nm厚Au/Pd、Pt、Cr膜层的结构和性能，结合离子束溅射膜层的对照，以及实际样品的沉积验证，得出了三个核心结论：
1. 同种厚度的不同金属膜层，颗粒的尺寸、形状、密度和团聚性存在天然差异；低温（-120℃）能有效减缓金属核的生长和颗粒团聚，让膜层结构更致密、连续性更好，是制备生物样品低温膜层的最佳温度条件。
2. 即便是同种金属、同厚度的膜层，因为溅射设备的构造和工艺参数（源–基底距离、真空度、氩气纯度、溅射电压、基底温度）不同，颗粒特征和膜层性能也会有显著差异。因此在制备膜层时，需要根据研究需求选择合适的溅射设备和工艺参数。
3. 用合适的平面磁控溅射设备制备的Au/Pd膜层，二次电子产率高、成像效果好、颗粒无明显生长，且制备和储存要求低，在低温生物样品表面沉积后还不会产生成像假象，是生物组织FE-SEM观测中，Pt和Cr膜层的优质替代材料，也为生物样品的FE-SEM样品前处理提供了更优的选择。
研究不仅明确了Au/Pd、Pt、Cr三种膜层的性能差异和适用场景，也为FE-SEM薄导电膜层的制备提供了实验参考。后续研究可通过精细化调控溅射工艺参数，进一步优化Au/Pd膜层的结构，提升其在更高放大倍数下的应用性能。
参考资料 A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Crproduced by magnetron sputtering for FE-SEM
