作者：孙千 本文转载自公众号：老千和他的朋友们。原文地址：https://mp.weixin.qq.com/s/O3Ww919Rmpji8-fxckS7Ew
电镜的自动图像采集功能，能直观呈现并定量分析生物样品的三维超微结构，这套完整的技术体系就是体电子显微学（volume electron microscopy ，vEM，也称体电镜）。样品制备工艺的进步、全自动成像模块的普及，再加上大规模三维数据处理算法的发展，共同让体电镜从实验室小众技术变成了规模化的科研工具。
在很长一段时间里，透射电镜（TEM）都是生物样品成像的标准选择，而扫描电镜（SEM）凭借自身独特的优势，在体电镜领域的应用越来越广泛。
大量实验已经证明，经过固定、重金属染色和树脂包埋的生物样品，SEM只要捕捉背散射电子（backscattered electrons, BSEs）并反转图像的明暗对比度，就能得到和TEM高度一致的超微结构图像。近几年BSE探测器的性能不断升级，再加上SEM整体光学系统和机械结构的优化，让SEM和TEM的成像质量差距越来越小。同时，SEM在三维成像的样品切片制备上更灵活，这一点是TEM很难做到的。
连续切片TEM（serial section TEM, ssTEM）需要人工制作连续的超薄切片，还必须把切片放到3毫米的小型载网上，就算近几年有了自动收集系统，制样的过程依然是这项技术最大的瓶颈。
连续块面SEM（serial block-face SEM, SBEM）和聚焦离子束SEM（focused ion-beam SEM, FIB/SEM）分别用金刚石刀、聚焦离子束实现样品的自动逐层切割，配合原位连续拍照，大大提升了捕捉细胞三维超微结构的能力。
阵列断层成像（也叫连续切片SEM）虽然还是需要制作连续切片，但切片可以放在更大的基底上，明显降低了切片转移和放置的难度，适配SEM的自动胶带收集系统也已经研发并投入使用。
SEM的核心缺点是成像速度慢：TEM用相机1秒就能拍好一张图，而SEM扫描同样大小的画面，需要几十秒到几分钟。更长的成像时间会放大样品带电和漂移带来的问题，导致画面局部变形，这是成像时必须严格控制的问题。
在硬件设计上，TEM针对包埋生物样品的成像，硬件配置和操作参数基本固定；而SEM有更多样的硬件搭配，可以选用不同类型的电子透镜和探测器，再加上加速电压、探测器选择、工作距离、束流、停留时间、样品偏压等可调参数，虽然让成像更灵活，却也大大增加了使用者操作和优化的难度。
此外，经过重金属重度染色的样品，用SE（secondary electron, SE）探测代替BSE探测，反转对比后也能得到类似TEM的图像，进一步拓展了SEM的成像方式。
本文只阐述SEM成像的基本物理规律，以及电子透镜、探测器的工作原理，为体电子显微学的成像条件优化提供系统的参考。
电子与生物样品的相互作用
SEM的工作原理很简单，用会聚的入射电子（primary electron, PE）束照射样品表面并逐点扫描，同时捕捉照射区域发出的信号电子，最后根据每个扫描点的信号电子数量还原出图像。入射电子和样品发生作用后，发出的电子能量是连续分布的，还会出现俄歇电子峰、芯损失峰、等离子体激元峰和弹性散射峰这些特征峰值。
行业里统一用50 eV作为能量分界线：能量高于50 eV的电子叫做BSE，也叫反射电子；能量低于50 eV的电子叫做二次电子（SE）。实际成像时，SE探测器和BSE探测器都没办法只捕捉对应的电子，这一特点会在探测系统部分详细说明。
电子与样品相互作用的相关物理过程。SE 代表SE，BSE 代表背散射电子
入射电子束和样品接触时，BSE和SE的产生过程可以通过示意图清晰看到。入射电子进入样品后，会因为材料内部的碰撞不断损失能量、改变运动方向，一部分打进样品的入射电子会重新从表面飞出来，其中能量超过50 eV的就是BSE。
因为BSE是在样品内部一定深度产生的，所以能携带样品表层以下的结构信息。
入射电子（PE）在样品内的运动轨迹：从初始入射，到BSE发射（红色箭头），再到入射电子在样品内停止（绿色箭头）。SE包括一次电子入射后立即发射的 SE1，以及BSE发射过程中产生的 SE2。R代表射程，即入射电子的穿透深度。
电子的运动轨迹由样品的原子序数和密度决定：原子序数高的材料，会让电子轨迹更短、偏转角度更大。经过重金属染色、树脂包埋的生物样品里，重金属的原子序数远高于树脂，会让电子产生更明显的能量损失和角度偏转，所以重金属集中的区域，BSE发出得更多，对应的信号强度也更强；在反转对比的BSE图像里，细胞膜这类重金属含量高的区域会显得更暗，和TEM的图像效果完全一致。
加速电压直接控制电子和样品的作用效果：加速电压升高，入射电子的能量变大，电子运动轨迹更长、偏转角度更小，最终表现为电子扎得更深、在样品里的扩散范围更大。电子在样品里的最大穿透深度叫做Kanaya Okayama 射程，具体的计算公式为：
公式里，A是质量数，E0是入射电子能量，ρ是材料密度，Z是原子序数
想要准确分析入射电子在样品里能扎多深、扩散范围有多大，最有效的方法是蒙特卡洛模拟，这个方法用随机数建模还原电子在样品里的运动轨迹。
针对树脂包埋、重金属染色的生物样品，只需要把树脂的原子序数和密度作为输入参数，就能算出电子的运动轨迹；就算是细胞膜这类重金属集中的区域，重金属含量也只有7%左右，对电子束扩散的影响可以忽略不计。免费开源的CASINO程序是最常用的模拟工具，能模拟不同加速电压下电子在样品里的轨迹并生成直观图像。
蒙特卡洛模拟结果，展示入射电子在样品内的展宽对加速电压的依赖关系。上图展示了 500 nm 以内的深度范围，下图聚焦于 50 nm 以内的深度范围。射程R随加速电压呈指数增长。
模拟结果清楚显示，电子穿透深度随加速电压升高而变大，高电压下的电子在横向的扩散范围也会变大：5 kV时电子穿透深度超过300 nm，扎得越深，能飞出来的BSE越少；样品表面捕捉到的BSE，绝大多数来自总穿透深度一半的位置，5 kV条件下对应150 nm深度，这个结论还需要更多模拟研究来验证。
另一部分入射电子会在样品里不断损失能量，最后停留在样品内部。导电样品里的剩余电子能快速消散，而绝缘样品会出现电子堆积，累积电荷后干扰正常成像。入射电子还会和样品里的电子碰撞并传递能量，被激发的电子里，能量低于50 eV且能飞出表面的就是SE。SE能量很低、没办法在样品里长距离移动，只能从金属样品表面下约1 nm、绝缘样品10到20 nm的深度飞出来。
SE分为SE1和SE2两种：SE1由入射电子直接激发产生，从照射点附近发出，能反映局部的材料和表面形貌信息；SE2由BSE飞出时激发产生，反映的是更大范围的内部结构信息。SE1和SE2没办法被探测器分开捕捉，实际得到的SE信号是两者的混合，所以同时包含局部表面信息和大范围内部信息。
用SEM给块状样品拍照时，比如FIB/SEM和SBEM，BSE信号能携带样品更深层的结构信息，入射电子束的扩散范围由加速电压决定。如果入射电子穿透深度超过切片厚度，也就是Z轴分辨率的核心标准，就会直接降低纵向分辨率，所以必须保证穿透深度小于或等于切片厚度。
SBEM用5 kV加速电压时，如果切片厚度低于150 nm，纵向分辨率会明显下降；把加速电压降到2 kV，电子穿透深度约80 nm，BSE飞出深度约40 nm，是适配薄切片的最佳参数。FIB/SEM需要的加速电压更低，具体由切片步长决定，4 nm切片步长对应的最佳加速电压是0.7到1.3 kV，蒙特卡洛模拟也验证了这个电压区间的合理性。
真空环境里的薄膜样品，入射电子可以完全穿过样品，内部扩散被严格限制。
真空环境中薄膜样品内的入射电子展宽与BSE产生过程
阵列断层成像的薄膜样品放在基底上，Z轴分辨率由样品厚度决定，就算入射电子穿透基底也不会影响纵向分辨率。
基底上的薄膜样品（阵列断层成像样品）的入射电子展宽与BSE产生过程。红色箭头表示薄膜样品产生的BSEspe，另外的红色箭头表示基底产生的BSEsub；绿色箭头表示入射电子在基底内停止前的运动轨迹；深灰色区域为入射电子在薄膜样品内的展宽，该区域会因电子束诱导导电效应产生导电性
高加速电压下，BSE信号包含样品信号BSEspe和基底信号BSEsub，硅这类均匀基底只会叠加一层均匀背景，不会降低分辨率；同时高加速电压会压缩入射电子在样品里的扩散范围，提升横向分辨率，但基底信号占比变高会削弱样品信号，综合推荐加速电压为1到10 kV，具体根据样品厚度调整。如果用氧化铟锡、铜这类金属镀膜基底，镀膜的颗粒结构会叠加在样品信号里，必须把加速电压控制在入射电子穿不透基底的范围。
SE信号是SE1和SE2的混合信号，SE2来源于BSE，所以SE探测的加速电压选择规则和BSE完全一样。高加速电压下，镀铜胶带基底的颗粒结构会出现在SE图像里，干扰样品成像。SE1能反映照射点的局部信息，在树脂这类绝缘材料里，SE1的发出范围能达到10到20 nm，高分辨率成像需要严格控制加速电压来缩小电子束扩散范围。
提升SE1的对比度也很关键，要让重金属集中的区域发出更多SE1、树脂区域发出更少SE1。SE的发出数量受材料成分、表面形貌、加速电压和表面污染的共同影响，树脂类型、固定方式、重金属染色方案都需要通过实验优化，锇固定搭配醋酸铀、天冬氨酸铅整体染色能得到最好的成像效果。
多束SEM（MSEM）以SE为主要探测信号，超薄切片经过等离子处理后，立刻用4%醋酸铀和3%柠檬酸铅做表面染色，能大幅提升画面对比度，这个方法只适用于阵列断层成像。样品表面的污染层会产生无关的SE，掩盖样品本身的信号，所以保持样品表面干净是拍出优质图像的必要条件。
FIB/SEM和SBEM的成像对象是块状绝缘样品，电子会在样品内部堆积，同时SE和BSE不断飞出。单个入射电子激发出的SE、BSE数量分别叫做SE发射产额(n)和BSE发射产额（δ），总电子发射产额σ=n+δ。总电子发射产额受样品材料和形貌影响，随加速电压呈现规律变化，存在两个σ=1的特征电压点，理论上可以完全抑制带电问题。实际成像时，加速电压略低于V2，样品会带微弱的正电，成像最稳定、带电干扰最小。
总电子发射产额（σ）随加速电压的变化规律。通常情况下，为实现绝缘样品的弱荷电、稳定成像，适宜将电压设置在略低于V2的位置（产额等于 1 的位置）
实际成像的样品是高电阻材料，不是理想的绝缘体，降低电阻是抑制带电的核心：提高样品重金属含量、在树脂里添加导电颗粒、低真空模式成像、聚焦气体注入都能有效缓解带电；减小电子束流可以根据欧姆定律降低样品表面和接地端的电压差；在样品周围镀导电材料、缩小样品尺寸来缩短导电路径，同样能抑制带电。
用硅这类导电基底的阵列断层成像，一般不会出现带电问题，入射电子穿透样品时会产生电子束诱导导电（EBIC），让导电区域延伸到基底；只有样品太厚、入射电子无法到达基底时，带电才会成为问题。用玻璃这类绝缘基底的阵列断层成像，带电是最大的难题，需要在样品和基底表面镀导电膜：真空蒸镀纳米碳膜、溅射铂或铂铱金属膜（厚度≤1 nm）、化学气相沉积（CVD）锇膜都是常用方案；提前在绝缘基底上涂导电材料，也能有效预防带电。
分析SEM图像的噪声时，要严格区分信噪比（SNR）和衬度噪声比（CNR）：信噪比是单个点位信号和噪声的比值，衬度噪声比是不同点位信号强度差值和噪声的比值，最终画面的清晰程度由衬度噪声比决定。
SEM的主要噪声来自入射电子束本身的统计波动，电子数量足够多时，波动可以近似为正态分布，平均电子数为N时，波动幅度为√N。单个像素入射入射电子平均数为NPE时，信噪比公式为：
NPE由入射电子束流、像素停留时间和元电荷共同决定，增大束流或延长停留时间都能降低噪声。
除了抑制入射电子本身的噪声，最大化单位入射电子激发出的信号电子数量是另一个关键方法：BSE探测时给样品加偏置电压能明显提升探测效率；SE的产生数量比BSE多，所以SE探测天生有更好的信噪比。提升衬度噪声比的核心是拉大染色区域和树脂区域的信号差异，BSE成像需要提高样品重金属含量，SE成像需要拉大不同区域的电子发射数量差异。
物镜
除了电子束在样品里的扩散范围和电子飞出深度，入射电子束的束斑点直径是决定分辨率的关键。
缩小束斑点直径需要场发射电子源和低像差的物镜，尤其是在FIB/SEM和SBEM的低加速电压成像中，把像差降到最低是核心要求。物镜是SEM里离样品最近的电子透镜，直接决定入射电子束直径和信号电子的探测效率。低加速电压下，要尽可能降低物镜的球差系数和色差系数，电子束离透镜中心轴越远，球差和色差就越大。想要保持最佳会聚角α，同时让电子束轨迹靠近中心轴，就必须缩短物镜焦距。
焦距（f）与电子透镜中心轴到入射电子束外边界的距离之间的关系。（左图）焦距较长时，中心轴到电子束外边界的距离较大；（右图）焦距较短时，该距离显著减小。
电子透镜分为磁透镜、静电透镜和磁–电复合透镜三类。磁透镜的线圈被铁基材料包裹，磁场在内外磁轭之间形成，产生聚焦效果。按照磁轭结构，磁透镜分为外透镜和半内透镜：外透镜的磁场被限制在透镜内部，样品在磁场外面；半内透镜把样品浸在磁场里（磁场强度取决于工作距离），焦距更短，也叫做半磁浸没透镜或snorkel lens。FIB/SEM专用的单极透镜是外磁轭极短的半内透镜，能给离子束镜筒留出空间。半内透镜和单极透镜的缺点是，短工作距离下很难扩大成像视野。
磁透镜的结构示意图：(a) 外透镜——内磁轭（绿色）与外磁轭（红色）之间形成的磁场，在透镜内部产生磁透镜效应。(b) 半内透镜——外磁轭（红色）缩短，内磁轭（绿色）下方形成磁场，透镜效应发生在磁轭下方。(c) 单极透镜——与半内透镜类似，磁场在单极透镜（内磁轭，绿色）下方产生，透镜效应发生在单极透镜下方。
静电透镜分为助推式和浸没式两种：助推式透镜在透镜内部的助推管和外壳之间加电压；浸没式透镜在透镜外壳和样品之间加电压差，给样品加偏置电压，也叫做阴极透镜（也就是我们常说的样品台减速模式）。
静电透镜的结构示意图：(a)在助推管与透镜外壳之间施加静电势，透镜效应发生在静电透镜的下部。(b)在透镜基座与样品之间施加电势，样品侧为负电势，透镜效应发生在透镜与样品之间。
浸没式透镜焦距更短，但样品本身变成了透镜的一部分，只适用于平整的样品；静电透镜正常工作需要静电场保持旋转对称，所以阵列断层成像可以用样品偏置型静电透镜，SBEM的样品表面不平整、FIB/SEM在共轴点成像有表面起伏，都没办法用常规浸没式静电透镜，只有通过加电极优化电场对称性后才能尝试使用。
商用电镜的物镜几乎不用纯静电系统，而是磁–电复合透镜，两种磁透镜和两种静电透镜可以组合出四种复合结构。磁透镜的球差和色差系数和加速电压无关，静电透镜的像差系数随加速电压降低而变小，所以复合透镜在低加速电压下有明显优势。
阵列断层成像的样品表面平整，能适配所有类型的物镜；多束SEM（MSEM）用浸没式静电透镜，能在样品上方形成静电场，加速SE并实现多束信号的独立探测。SBEM和FIB/SEM不能用浸没式静电透镜，通常选用助推型静电透镜的复合透镜或单极透镜，物镜选择必须和要探测的信号类型匹配。
工作距离（WD）是物镜和样品之间的距离，焦距越短、工作距离越小，电子束束斑点就越小、成像越清晰。SBEM需要给金刚石刀和BSE探测器留出空间，没办法过度缩短工作距离；常规FIB/SEM在离子束和电子束的共轴点完成切割和成像，工作距离同样受限。
阵列断层成像可以实现极短的工作距离，不会发生机械碰撞，有利于高分辨率成像；离子束和SEM镜筒呈90°夹角的系统，也能大幅缩短工作距离。传统FIB/SEM可以通过精准控制样品台姿态，在成像时实现极短工作距离，但这个方法需要高精度的样品台控制，会延长观察时间。
样品台固定的FIB/SEM系统里，BSE撞到样品侧壁会激发出SE，被探测器捕捉后会引入额外信号，样品侧壁的形状会改变信号强度，需要考虑发射深度带来的信号梯度变化。
SBEM、FIB/SEM 与阵列断层成像中，扫描电镜成像的工作距离（WD）构型：(a) SBEM 中的工作距离。(b) 样品台无移动、在共轴点交替完成FIB铣削与SEM成像时，FIB/SEM 的工作距离。同时展示了BSE（红色箭头）撞击样品侧壁产生SE（灰色虚箭头）的过程。(c) 阵列断层成像中的工作距离。(d) FIB与SEM呈 90° 夹角布置时的工作距离。(e) 传统 FIB/SEM 中，采用小尺寸样品与样品台移动实现的短工作距离。(f) 从 (e) 的构型移动样品台后，聚焦离子束铣削的构型。
探测系统
25年前，SEM只有两种探测器：真空腔室内的传统SE探测器（ET）、物镜正下方的传统BSE探测器，这两种探测器至今还在商用设备里广泛使用。
近25年，探测系统实现了两大核心突破：一是镜筒内（through-the-lens, TTL）探测器的普及，这种探测器装在物镜内部，捕捉穿过物镜的信号电子，解决了短工作距离下传统探测器信号衰减的问题；二是物镜类型越来越多，物镜产生的磁场或电场会改变信号电子的运动轨迹，导致探测信号的特点发生明显变化，所以探测系统需要和物镜、成像条件整体匹配。
传统SE探测器装在真空腔室内，优先捕捉朝向探测器方向发出的SE，样品表面的粗糙程度会以阴影对比的形式呈现在画面里。工作距离缩短会缩小物镜和样品的间隙，SE很难到达传统探测器，信号强度大幅下降；半内透镜、单极透镜产生的磁场会让SE绕中心轴螺旋运动，进一步削弱传统探测器的信号。
助推式透镜的泄漏电场会把能量低于40 eV的SE吸进透镜，只有高能电子能被传统探测器捕捉；浸没式静电透镜的强电场会完全改变SE轨迹，传统探测器无法捕捉到有效信号。因此，传统SE探测器只适用于长工作距离、中低放大倍数的整体形貌观察。
安装在扫描电镜腔室内的传统SE （ET）探测器与传统BSE探测器
传统BSE探测器是环形的，中间能让入射电子束穿过，早期只能检测5 keV以上的BSE，新一代探测器能检测1 keV以下的低能电子。浸没式静电透镜给样品加负偏压时，SE会被吸进透镜，而高能BSE的轨迹受影响较小，能被探测器高效捕捉；电场对BSE的加速作用，能让低能BSE被有效探测，信噪比提升一个量级，扫描速度提升20倍。
目前还没有研究明确被探测BSE的精确能量范围，它的能量随成像条件和探测系统变化，还需要进一步研究验证。传统BSE探测器可以和传统SE探测器或镜筒内探测器配合，实现SE和BSE的同时捕捉。
侧向探测的镜筒内（TTL）探测器装在物镜上方的侧面位置，和磁场浸没式物镜配合使用。电场或磁电复合场能捕捉进入透镜的SE；BSE和透镜内反射板碰撞激发出的SE，能被探测器捕捉。给下部电极加负电压可以阻挡SE进入透镜，实现BSE的选择性探测；给反射板加正电压，可以回收碰撞产生的SE，实现SE的选择性探测。
探测器的能量接收范围由几何结构和电极电压决定，能调整SE和BSE的混合比例，但没办法同时捕捉两种信号；给样品加偏压后，就无法实现选择性探测。
侧向布置的镜筒内（TTL）探测器
环形镜筒内探测器的外形和传统BSE探测器一样，装在物镜内部。和助推式静电透镜组合时，探测器处于高正电位，能高效加速并捕捉SE。用在没有助推器的磁透镜里时，工作模式和传统BSE探测器一致，选择性捕捉BSE；给样品加偏压后，还能同时捕捉SE信号。
适配助推型静电透镜的环形镜筒内探测器（左），无助推器透镜的环形镜筒内探测器（右）
带栅极的环形镜筒内探测器装在助推式静电透镜上，下方配有栅极。给栅极加负电压，可以筛选能量高于阈值的电子，实现BSE的选择性探测；给样品加偏压后，信号电子能量升高，需要提高栅极负电压才能保持选择性探测效果。
适配助推型静电透镜、带栅极的环形镜筒内探测器
被探测电子的能量、发射角度是优化探测系统的关键参数，可以通过接收图或接收映射总结特点，模拟和实验是主要的研究方法。信号电子的探测能量和发射角度有关，就算探测系统结构相近，硬件尺寸和成像条件的差异也会导致信号接收特点明显不同。模拟结果只能作为成像条件的参考，每台设备的最佳参数都必须通过实验验证确定。
总结
加速电压越高，入射电子在样品里的扩散范围就越大，所以SBEM、FIB/SEM这类块状样品成像需要用低加速电压，保证Z轴分辨率；阵列断层成像的Z轴分辨率由样品厚度决定，可以灵活选用低电压或相对较高的加速电压。
高分辨率成像的核心是缩小工作距离，阵列断层成像在这一点上有明显优势；传统FIB/SEM系统里，移动样品台实现短工作距离成像、原位切割的交替模式，比固定在共轴点成像效果更好；90°夹角的FIB/SEM系统能进一步提升分辨率。
物镜和探测系统的选择是SEM性能优化的核心，短焦距物镜最适合高分辨率成像；能探测的电子类型由物镜、探测系统和成像条件共同决定。现有的模拟研究可以为成像条件提供参考，但最终的最佳参数设置，必须针对每台设备通过实验确定。
参考资料
1 Peddie C J, Genoud C, Kreshuk A, Meechan K, Micheva K D, Narayan K, Pape C, Parton R G, Schieber N L, and Schwab Y (2022) Volume electron microscopy. Nat. Rev. Method Primers 2: 1–23.
2 Kievits A J, Lane R, Carroll E C, and Hoogenboom J P (2022) How innovations in methodology offer new prospects for volume electron microscopy. J. Microsc. 287: 114–137.
3 Titze B and Genoud C (2016) Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biol. Cell 108: 307–323.
4 Mitsuo Suga, Yusuke Hirabayashi, Physical basics of scanning electron microscopy in volume electron microscopy,Microscopy, Volume 74, Issue 3, June 2025, Pages 201–214,
