作者：孙千 本文转载自公众号：老千和他的朋友们。原文地址：https://mp.weixin.qq.com/s/mtWeeI_myVAuTm8LTkxPeQ
水凝胶是一类能吸收并保持大量水分的三维交联高分子材料。它的现代生物医学应用，通常从1960年算起。当时，捷克科学家Wichterle与Lim将聚甲基丙烯酸羟乙酯（PHEMA）水凝胶用于软性隐形眼镜，证明了这类材料可以在含水状态下与生物环境相容。
此后，水凝胶的发展沿着两个方向推进：一方面是材料化学的改进，包括天然高分子改性、合成高分子设计、光交联体系引入；另一方面是应用场景的扩展，从眼科材料逐步走向组织工程、药物载体、伤口敷料和3D生物打印。
到20世纪80年代，随着组织工程概念兴起，水凝胶开始被视作细胞外基质的类似物。研究者不再只关注含水量和力学强度，而是开始关心材料内部的孔结构如何影响细胞附着、迁移和组织形成。
进入21世纪后，甲基丙烯酸酯化明胶（GelMA）、甲基丙烯酸酯化透明质酸（HAMA）等材料体系被广泛使用。它们的优点是交联条件较温和，适合包埋细胞，也便于调控凝胶速度和力学性能。水凝胶研究由此进入更精细的阶段：材料设计不再满足于“成胶”，而是要进一步控制网络结构、孔径、降解速度和细胞相互作用。
随着研究深入，表征问题逐渐暴露出来。水凝胶的真实结构很容易被制样过程改变，尤其在电子显微镜观察中，样品需要脱水、干燥或镀膜，而这些步骤都可能引入伪影。于是，一个原本属于实验技术层面的问题，开始影响整个领域对构效关系的判断。
一、常规SEM：干燥带来的结构变化
扫描电镜（SEM）是观察水凝胶表面形貌的常用设备。它的工作环境要求高真空，因此样品必须先脱水并获得导电性。常用方法有两种：冷冻干燥和超临界CO₂干燥。
冷冻干燥法的步骤不复杂。样品先经过液氮冷冻，再在真空条件下让固态水分升华。过去，这种方法常被用于水凝胶孔隙结构观察，但它得到的孔结构并不一定代表原生状态。
实验结果显示，冷冻干燥后的GelMA和HAMA常呈现明显的微米级孔隙。这些孔隙的尺寸和排列，与样品交联时间之间不一定存在稳定关系。部分样品中还能看到具有方向性的孔道，这更像是冰晶生长后留下的痕迹。
也就是说，冷冻干燥法的主要问题不在成像本身，而在样品制备：冷冻过程中冰晶形成并膨胀，挤压聚合物网络；随后的真空干燥又可能使失去水分支撑的网络收缩或塌陷。
超临界CO₂干燥法通常比冷冻干燥更温和。它利用CO₂在超临界状态下置换样品中的溶剂，减少气液界面造成的张力和形变。在水凝胶观察中，超临界干燥样品有时能看到更接近纳米尺度的网络轮廓。但它仍然需要样品完全脱水，因此不能完全排除网络收缩。此外，在较高放大倍数下，样品还可能出现荷电效应和电子束损伤，影响孔径测量的稳定性。
图1 不同电镜技术的制样路径示意。常规SEM依赖脱水干燥；ESEM尽量保持水合；Cryo-SEM采用玻璃化冷冻；TEM则以树脂包埋和超薄切片为基础。
图2 五种制样—成像组合下的水凝胶形貌示意。不同方法得到的结构尺度差异明显，其中冷冻干燥SEM更易呈现微米级孔道。
二、ESEM：水合状态下的分辨率限制
环境扫描电镜（ESEM）的思路是：既然干燥会改变结构，那就尽量让样品保持湿润。ESEM样品腔可以维持低真空和较高水汽压，样品不必完全脱水，也不一定需要镀膜。
从理论上看，ESEM适合观察水凝胶的原生表面形貌。但实际操作中，分辨率往往受限。水凝胶含水量高，电子束进入样品后会发生较强散射，同时容易产生荷电。因此，很多水凝胶样品只能在较低放大倍数下获得可用图像。如果为了提高分辨率而降低腔室水汽压，样品又会逐渐失水，出现收缩和表面形变。
研究表明，ESEM对GelMA和HAMA的观察主要停留在较低倍形貌层面，难以清晰分辨纳米级孔隙，也不容易完成稳定的孔径统计。所以，ESEM更适合作为初步观察手段，而不是精细结构定量方法。
图3 不同技术对水凝胶孔径的测量结果示意。 Cryo-SEM和TEM可给出纳米级孔径信息；冷冻干燥SEM结果明显偏大；ESEM和超临界SEM多用于定性观察。
三、Cryo-SEM：近原生结构的折中方案
冷冻扫描电镜（Cryo-SEM）试图在另一个层面解决矛盾：不经过常温干燥，而是把样品冷冻起来。高压冷冻技术可以在很短时间内将样品降温，使水分进入无定形玻璃态，减少冰晶形成。随后，样品在低温环境中断裂、升华，并镀上导电层，再进行观察。
这种方法的优势是能保留更接近水合状态的三维网络。实验中，Cryo-SEM观察到的GelMA和HAMA孔径多在纳米范围，而且孔径随交联时间延长而减小，这符合交联密度增加的一般规律。相比冷冻干燥SEM，Cryo-SEM的结果更合理，也更适合观察断面内部结构。
但Cryo-SEM也有实际限制。高压冷冻适合处理的样品体积较小，通常在1 mm³左右，取样代表性有限。制样流程也更复杂，需要高压冷冻仪、低温转移系统和低温SEM台。这些条件提高了实验成本和操作门槛。此外，冷冻样品在电子束下仍可能损伤，可用放大倍数并非无限提高。
四、TEM：纳米结构定量的基准方法
透射电镜（TEM）观察的是穿过超薄样品的电子信号，因此分辨率通常高于常规SEM。水凝胶TEM制样一般包括化学固定、脱水、树脂包埋和超薄切片。样品被包埋在树脂中后，切成约70 nm薄片，再用重金属染色增强对比度。
TEM的优势在于能清楚展示水凝胶的纳米网络。实验中，GelMA和HAMA样品在TEM下呈现细密的多孔结构，孔径多为几十纳米。交联时间从30秒延长到2分钟时，两种水凝胶的平均孔径都明显减小，趋势稳定。这说明TEM结果更符合交联密度变化带来的结构变化。
除了纯材料结构，TEM还能观察细胞与水凝胶的相互作用。当脂肪干细胞被包埋在GelMA中培养后，TEM可以同时看到细胞轮廓、胞内结构和周围水凝胶网络。研究中，细胞所在区域与完整凝胶区域的衬度不同，说明细胞可能对周围基质产生降解或重塑。培养较长时间后，还能看到细胞分泌的胶原纤维及其周期性条纹。这类信息对理解细胞如何感知和改造基质很重要。
当然，TEM也有局限。制样步骤较长，样品需要脱水和树脂包埋，并非完全保持原生水合状态。而且TEM图像通常反映的是二维截面结构，要代表整体样品，需要观察多个区域并进行统计。
图4 细胞包埋水凝胶的TEM观察示意。 TEM可同时呈现细胞结构、水凝胶网络以及细胞对基质的局部作用。
五、不同技术如何选择？
表1汇总了五种电镜表征方案的特点。
表1 不同电镜技术用于水凝胶微结构表征的性能对比
选择技术时，应先明确研究问题。如果只是观察干燥后的表面形态，常规SEM可能够用。如果关心水合表面变化，ESEM有一定价值。如果希望尽量保留三维网络并观察断面，Cryo-SEM更合适。如果研究重点是纳米孔径、交联密度关系或细胞与基质的相互作用，TEM更适合作为基准方法。
这里不是简单推荐某一种仪器，而是提醒研究者：水凝胶结构表征不能只看设备名称，还要看制样过程是否引入伪影。冷冻干燥SEM过去被广泛使用，并不代表它能准确反映原生孔隙。同样，ESEM虽然保持水合，也未必能满足纳米结构定量要求。
目前，TEM在水凝胶纳米结构定量方面表现最稳定，但它仍需要规范制样和多区域统计。Cryo-SEM适合作为补充手段，特别是在三维断面信息方面。常规干燥SEM更适合作为前期筛选工具，而不是构效关系分析的唯一依据。
然而，目前的对比研究也有局限。实验材料主要是GelMA和HAMA，浓度和交联条件有限。对于其他合成水凝胶、复合水凝胶或高细胞密度体系，伪影程度可能不同。
水凝胶研究的进步，既依赖新材料开发，也依赖表征方法的可靠性。当结构测量结果直接影响对细胞行为、物质传输和组织再生的解释时，表征方法本身就应成为实验设计的一部分。
参考资料
Jeanne Aigoin; Comparative Analysis of Electron Microscopy Techniques for Hydrogel Microarchitecture Characterization: SEM, Cryo-SEM, ESEM, and TEM. ACS Omega 22 April 2025
