作者：孙千 本文转载自公众号：老千和他的朋友们。原文地址：https://mp.weixin.qq.com/s/5knEtUmuutzHSsXnUMCpZg
近年来，冷冻电镜（cryo-EM）技术在结构生物学领域取得了革命性的进展。这些进步主要归功于几个关键因素：量子效率更高的直接电子探测器，配备自动对准和数据采集功能的现代化电镜系统，用于密度图分类和三维重建的算法软件的显著改进，以及更为稳定、可重复的样品支撑技术。这些技术创新共同推动了冷冻电镜结构测定能力的飞跃式发展，使其成为解析生物大分子结构的强大工具。
然而，尽管硬件和软件技术日新月异，冷冻电镜结构测定的主要瓶颈依然是样品制备环节。这一限制因素主要源于两个方面的挑战：
首先，在创建适合玻璃化和成像的薄水层过程中，生物样品不可避免地暴露于与其原生环境（试管或细胞内部）截然不同的物理化学条件下。这种环境变化对目标分子和复合物的影响往往难以预测，一旦对样品造成结构破坏，通常难以挽回和修复。
其次，冷冻电镜样品制备是一个极其精细的工艺过程，需要操作者通过一系列详尽的准备步骤进行熟练操作和谨慎技术处理。这种复杂性常使新手以及有经验的电镜专家感到困惑，因为在实践中难以清晰区分源自样品本身的问题与技术和方法学的缺陷。
这些挑战共同构成了冷冻电镜项目进展的阻碍因素，无论冷冻电镜其他方面的技术如何精进，样品制备的局限性仍然是结构测定成功与否的决定性因素。
本文旨在提供一套系统性的方法论来解决样品制备中的各种挑战，帮助新晋电镜研究者规避常见陷阱，同时为样品制备流程的各个环节提供详实的操作规程，并就电镜参数设置和数据采集策略提出建议，以最大化实验效率和成功率。
需要说明的是，本文并不着重于冷冻电镜的理论基础和历史沿革。鉴于冷冻电镜领域的迅猛发展态势，随着技术的不断革新，相关方法将持续演进。尽管如此，本文所阐述的系统性样品制备方法代表了当前先进的技术水平，并且即使在未来出现颠覆性技术突破的情况下，这种系统性的思路和方法依然具有重要的参考价值。
1 样品制备的系统性方法论
冷冻电镜样品制备的核心可以简明定义为：将一份生物材料（通常是纯化的蛋白质复合物）的水溶液样品应用于支撑结构（载网），将其厚度减小至可能最薄的层（10-80nm，视生物分子大小而定），随后以足够快的速度冷冻以防止水分子结晶。这一过程的基本原理与Dubochet及其同事在二十世纪八十年代首次开发该方法时基本一致。
然而，正如Dubochet当时所敏锐观察到的，这一过程的诸多方面存在根本性挑战，主要源于我们对纯化复合物从试管到玻璃态薄冰层转变过程中所遭遇的微观表面、材料特性和动态变化理解不足，掌控程度也不够精确。这一现实意味着我们在冷冻电镜载网上观察到的分子状态，与我们基于溶液中特性所预期的状态往往存在显著差异。
为了以最高效的方式应对这一挑战——无论从研究者时间投入还是电镜等昂贵仪器资源的利用角度考量——样品制备过程的每个步骤都应该被系统评估。这种方法使研究者能够更准确地确定问题发生的环节，从而系统性地追求优质样品的制备目标，最终以最少的数据处理工作量和人力投入获得高分辨率结构。整个过程概述于图1，以下将详细阐述各个环节，并提供执行上述大多数步骤的具体方法。
图1 冷冻电镜结构测定。图示展示了三维结构测定的系统方法。左侧栏列出了主要步骤。每个步骤应依次执行，只有在一个步骤成功完成后，科学家才能进行下一步。第二栏展示了核糖体的示例数据。显微照片上的比例尺为50nm。每个步骤都应根据第三栏列出的标准进行评估，如有问题需返回先前步骤进行故障排除。最后一栏列出了需要使用的电子显微镜类别，如表1所定义。
Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM L.A.Passmore1,C.J.Russo1
表1 冷冻电镜的一般类别（2016年）
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电镜类别 |
典型示例 |
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入门级 |
FEI TI2/Spirit, JEOL 1400 |
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中端 |
FEI F20/Talos, JEOL 2100F |
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中高端 |
FEI F30/Polara, JEOL 3200FS |
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高端 |
FEI Titan Krios |
1.1 蛋白质样品制备
系统方法的第一步是采用生物化学技术全面评估蛋白质样品的组分构成和均一性（图1）。污染蛋白质或降解产物可能显著干扰复合物的稳定性和后续的颗粒图像计算分析，从而浪费更为耗时、昂贵的冷冻电镜数据采集和图像处理环节的资源投入。研究者可以利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）评估样品均一性，并可借助质谱技术精确鉴定蛋白质成分。图1展示了一例纯化核糖体样品的考马斯亮蓝染色凝胶电泳结果。
确保样品中仅存在单一目标分子种群至关重要，为此可以采用多种互补技术进行判断，包括原生PAGE、体积排阻色谱（其示例色谱图如图1所示）、动态光散射（DLS）以及体积排阻色谱–多角度光散射联用技术（SEC-MALS）。通过这些方法可以有效监测亚基结合状态，进而可以通过调整缓冲条件（如盐浓度、pH值和洗涤剂类型）优化样品稳定性。此外，应当通过功能测定或生物化学分析方法验证蛋白质在特定缓冲条件下的活性保留情况。
所有这些表征和优化步骤都应在制备首个电镜样品之前完成，因为任何电镜样品的质量上限不会超过其制备源的质量。
冷冻电镜样品通常使用3μl浓度为0.05-5μM的蛋白质溶液制备。因此，确保蛋白质复合物在这些相对稀释的浓度下保持完整结构至关重要。如果已知亚基之间的解离常数（Kd），可以理论计算预期其是否会在目标浓度下保持完整。在实验层面，可以通过在逐渐降低的浓度梯度下反复进行体积排阻色谱分析，以确认复合物在冷冻电镜所需浓度范围内的结构完整性。
若复合物确实在稀释条件下发生解离，研究者可以考虑以下几种策略：可以在显著高于Kd的浓度下工作，并相应调整后续的等离子体清洗和样品吸附条件，以实现仅允许复合物形成单分子层的超薄样品层；或者，可以采用化学交联剂共价连接亚基，从而防止它们在稀释后解离（Plaschka et al., 2015）。交联处理可以在溶液中直接进行，也可以在甘油或蔗糖密度梯度（GraFix技术）内进行（Kastner et al., 2008）。
值得注意的是，必须最大限度地减少（例如，通过优化蛋白质和交联剂浓度）或去除（例如，通过密度梯度离心或体积排阻色谱）多个复合物相互交联而产生的聚集体，以确保样品质量。
1.2负染色电镜分析
蛋白质纯化完成后，下一个关键步骤是使用负染色电镜技术进行初步评估（图1）。在这种方法中，蛋白质分子被包埋在重金属盐（如铀、钼或钨）形成的染色层中，这些金属盐如同外壳般环绕蛋白质分子（Brenner & Horne, 1959）。由于染色剂的电子密度约为蛋白质的三倍，即使在低电子剂量和常规电镜条件下也能获得优异的对比度。图1展示了一张典型的负染色显微图像。
负染色方法的显著优势在于其速度——制备和成像样品所需的时间与进行凝胶电泳分析相当——因此特别适合用于快速评估样品制备过程中的各种参数变化，如pH值调整、盐浓度和缓冲条件的优化，或色谱分离的不同组分的质量比较。该技术能够清晰显示分子的溶剂排除表面和整体形貌，因此可用于评估蛋白质样品的均一性、尺寸分布以及结合状况。
高质量均一的样品会呈现大小一致的离散颗粒。对平移对齐（但未旋转对齐）的负染色颗粒集进行平均处理将提供蛋白质直径的准确估计值。这一数据应与通过溶液方法（如DLS或SEC-MALS）确定的分子尺寸保持一致。如果观察到颗粒的大小和形状不一致，这明确表明样品存在问题，应在进行冷冻电镜样品制备之前进行深入的故障排查。
值得一提的是，负染色技术也可用于确定初步的三维结构，这些结构可以作为后续冷冻电镜结构测定的起点，尽管在现代实践中，借助较新的算法生成三维重建的初始模型往往不需要这一步骤。
负染色样品制备的详细方法已在先前文献中有所描述，我们建议读者参考这些资料以获取具体操作细节。需要强调的是，即使在高分辨率冷冻电镜技术日益普及的今天，负染色仍然是一种快速、经济且富有价值的方法，可用于初步评估蛋白质样品的质量和适用性。
1.3诊断性冷冻电镜
当确认所制备的蛋白质样品达到单分散状态，且在明确定义的溶液条件下保持稳定，并在负染色中呈现均匀分布的离散颗粒后，便可进行冷冻电镜评估（图1）。
初始阶段应采用诊断水平的冷冻电镜检查，重点评估样品的三个关键特性：（1）蛋白质浓度与稳定性；（2）冰层厚度及其在载网上的均匀分布；（3）冰的相态（应均匀呈现无定形态，而非结晶状态）。这三项特性在载网上应具备足够的一致性，以产生多个适合数据收集的区域。图1展示了一个核糖体样品的显微图像，清晰呈现了这些特性。
冷冻电镜的标准基底结构由支撑穿孔箔片的3毫米金属载网构成（图2）。箔片上具有规则排列的孔阵列，可采用多种材料制作，其中最为常用的是无定形碳（表2）。研究表明，当载网和箔片采用相同材料（金）时，能显著提高支撑结构的稳定性，并将成像过程中样品的移动减少一个数量级以上，从而大幅提升图像质量（Russo & Passmore, 2014c）。
图2 冷冻电镜支架。这里展示的支架包括一个3毫米金属载网（A）和覆盖在载网表面的多孔金箔（B和C）。薄膜（厚度约2-30埃）可以添加在多孔箔的顶部。比例尺分别为（A）0.5毫米，（B）50微米和（C）5微米。
表2 特定应用的试样支撑几何形状
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模式 |
载网 |
多孔箔 |
膜 |
|
负染色 |
400目 |
无 |
50-100 Å 非晶碳 |
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诊断性冷冻 |
300目 |
1.2/1.3 μm |
无/20 Å 非晶碳 |
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中等分辨率冷冻 (≥3.5 Å) |
300目 |
1.2/1.3 μm |
无/20 Å 非晶碳 |
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高分辨率冷冻 (<3.5 Å) >400 kDa |
300目 |
1.2/1.3 μm |
无/20 Å 非晶碳 |
|
高分辨率冷冻 (<3.5 Å) <400 kDa |
300目 |
1.2/1.3 μm |
无/石墨烯 |
|
超高分辨率冷冻 (<2.8 Å) |
300目 |
0.6/1.0 μm |
无/石墨烯 |
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冷冻断层扫描：细胞 (>30 Å) |
200目 |
2.0/2.0 μm* |
无 |
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冷冻断层扫描：高分辨率亚断层平均 (<15 Å) |
300目 |
1.2/1.3 μm |
无/20 Å 非晶碳 |
*备注：更大的孔可用于特别大的标本。
在玻璃化过程中，蛋白质在箔片孔中以水合、天然状态得以保存。由于蛋白质在玻璃态冰中对比度相对较低，确保冰层厚度仅略微超过颗粒直径至关重要，这有助于最大化成像对比度。若水层过薄，则会导致蛋白质颗粒被排除，这种现象通常表现为孔中心区域出现无颗粒的圆形冰区。
对于给定浓度的稳定复合物，应通过调节以下几个关键参数来优化颗粒分布和冰层厚度：（1）样品吸附条件和等离子体处理参数；（2）添加微量洗涤剂；（3）在箔片表面添加一层超薄无定形碳或石墨烯，以促进颗粒在孔上的吸附。目前，这些优化过程仍然主要依赖试错法进行，因此必须采取系统化的方法以最小化不可控因素的影响。
蛋白质在接触界面时通常容易发生变性（Seigel , 1997），而在玻璃化过程中存在多种界面类型。这些界面包括疏水性气–水界面、无定形碳支撑层、用于制作载网的铜、金及其他金属材料，甚至包括用于吸除多余液体的纤维素滤纸。其中，气–水界面可能是最为棘手的，因为为获得薄冰层，颗粒必须在冻结前靠近此界面。气–水界面的疏水性质意味着它可能导致众多蛋白质和复合物发生吸附，进而可能引起变性。
对于特定浓度的蛋白质样品，可以理论计算在薄层玻璃态冰中应观察到的颗粒数量。例如，对于1-MDa分子量的蛋白质，在800 Å厚的玻璃态冰中，2 mg/ml的溶液理论上应产生约100颗粒/μm²。在相同浓度条件下，250-kDa蛋白质应产生约400颗粒/μm²。然而在实际情况中，溶液中的蛋白质浓度与载网上观察到的蛋白质浓度往往存在差异：若颗粒倾向于吸附到特定表面，则观察到的蛋白质密度可能高于理论预期；若颗粒倾向于排斥表面（或被吸引至支撑物或其他表面，如吸水滤纸），则密度可能低于预期。
通过调整缓冲条件（例如改变pH值或盐浓度，添加洗涤剂、脂质或其他化学修饰剂如交联剂）可有效改变蛋白质与界面的相互作用特性。
若支撑物过度疏水，例如由于等离子体处理不足或受到碳氢化合物污染，可能会强烈吸附蛋白质，导致孔中的颗粒浓度远低于施加液滴中的原始浓度。这明确表明样品存在问题。相反情况也可能发生，即颗粒可能粘附在气–水界面上，在移除大部分水分并形成薄层之前人为地浓缩颗粒。这会导致孔中观察到的颗粒浓度远高于液滴中的原始浓度，同样表明样品存在问题。
通常，粘附在界面上的颗粒呈现低对比度，且可能部分或完全变性。此外，由于这些颗粒在表面上以不同程度展开，其尺寸可能显得比预期更大（Seigel , 1997）。在进行大规模冷冻数据收集前，必须解决这些界面相互作用问题。
1.4 初始冷冻电镜数据收集
一旦优化了蛋白质密度、冰层厚度和质量，应在中等性能的电镜上进行初始数据收集（表1）。此阶段的主要目标是获得具有高分辨率特征（至少达到α螺旋分辨率或更佳）的无参考二维分类平均图像。初始阶段应采用手动挑选颗粒的方法，以避免模板匹配中潜在的““Einstein from noise”问题（Henderson, 2013）。
利用现代场发射电镜和直接电子探测器，仅需数百个颗粒图像即可生成具有足够分辨率以观察α螺旋结构的二维分类。因此，包含数千个颗粒的初始数据集通常足以产生若干高分辨率分类。
图1展示了核糖体样品的高分辨率二维分类结果。若未能获得高分辨率二维分类，应重新评估并优化样品，包括修改蛋白质制备方法、缓冲液组成、洗涤剂类型和表面修饰条件，以及考虑添加无定形碳或石墨烯等支撑薄膜。无法良好对齐的颗粒可能已部分或完全变性，若后续计算和验证过程不够谨慎，可能导致结构解析错误。
迄今为止，许多已发表的高分辨率结构都需要舍弃初始收集数据中的大部分颗粒。不同样品间被舍弃的“低质量“颗粒比例可相差数个数量级。我们认为这些被舍弃颗粒中的大多数可能是在样品制备过程中受损。
通过采用上述标准评估样品制备质量，可以系统优化样品并提高有效颗粒产率。这种方法通常比收集超大型数据集并舍弃大部分颗粒以达到所需分辨率更为合理。提高颗粒有效率不仅能使整个结构解析过程更加高效，还能显著提高成功率。
一旦收集到能够产生具有高质量二维分类的初步数据集，即可在中高端电镜上收集包含数百张显微照片和数万个颗粒的更大规模数据集，从中计算初始三维重构图。此时应评估几个关键因素：首先，二维分类是否呈现了颗粒的多个不同视角，尺寸是否自洽，且每个分类是否均显示二级结构特征？其次，颗粒的取向分布是否足以计算具有各向同性分辨率的三维结构？
图1展示了核糖体相对于无定形碳基底的取向角的等面积投影图。尽管这些核糖体样品表现出一定的优势取向，但其对傅里叶空间的覆盖度仍足以形成高分辨率结构。若取向分布不理想，可通过调整缓冲液组成、添加洗涤剂、改变等离子体处理条件，或使用石墨烯或无定形碳等替代表面材料来改善分布并促进复合物呈现更多样化的视角。
蛋白质交联也可改变颗粒取向，因为对带电表面氨基酸（通常是赖氨酸）的化学修饰能改变分子的表面特性及其与支撑表面和气–水界面的相互作用（Bernecky, 2016）。通过收集小型测试数据集，即可有效确定制备条件的调整是否显著改善了颗粒取向分布。
1.5 高分辨率数据收集
若初始三维重构的分辨率达到与颗粒数量和图像采集参数相符的合理水平，则应在高端电镜上进行更大规模的数据收集，以获取高分辨率结构（图1）。“合理分辨率“的定义虽然具有一定主观性，但最终应取决于具体生物学问题对分辨率的要求以及当前技术水平。
作为参考指南，我们建议在现阶段，从约10至5万个不对称单元的颗粒图像应常规可获得亚纳米级分辨率。基于此考量，应利用最先进的可用电镜收集大型数据集（通常为500-1000张显微照片，约24小时电镜时间）：目前最佳配置为300kev仪器，搭配市场上领先的直接电子探测器（表1和表3）。
表3冷冻电镜用电子探测器（2017年）
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探测器类型 |
当前示例 |
像素尺寸 |
像素数量 |
帧率 (Hz) |
推荐电子通量 (最佳[范围]) e⁻/像素/秒) |
|
荧光屏-CCD |
Gatan Orius 830 |
7.4 |
2048 × 2048 |
1 |
－ |
|
Gatan US1000 |
14 |
2048 × 2048 |
1.5/15 |
－ |
|
|
荧光屏-CMOS |
Tietz TemCam |
15.6 |
4096 × 4096 |
1 |
－ |
|
Gatan OneView |
15 |
4096 × 4096 |
25 |
－ |
|
|
FEI Ceta |
14 |
4096 × 4096 |
32 |
－ |
|
|
直接积分型 |
Direct El. DE16ᵃ |
6.5 |
4096 × 4096 |
60 |
～ 240 |
|
Direct El. DE20ᵃ |
6.4 |
5120 × 3840 |
32 |
～ 100 |
|
|
FEI Falcon 2ᵃ |
14 |
4096 × 4096 |
18 |
50 (300 keV) 40 (200 keV)ᵇ |
|
|
FEI Falcon 3ᵃ |
14 |
4096 × 4096 |
32 |
100 (300 keV) |
|
|
直接计数型 |
Gatan K2 |
5 |
3838 × 3710 |
400 |
5 (300 keV) |
a 这些探测器也可以在电子计数模式下运行，但当前的帧速率使其在常规数据收集中不切实际。
b 在一种能量下的通量f₀可以通过方程f₁ = f₀(β₁²/β₀²)被合理准确地缩放到与透射电子显微镜相关的其他能量，其中β是电子速度与光速的比率。
具体数据收集策略将根据颗粒大小、目标分辨率以及研究人员可获取的特定电子显微镜设备而调整。我们针对不同样品类型的现行数据收集建议将在后面详细讨论。
所有生物分子复合物在溶液中均存在多种构象状态，要全面解析每一种构象，需要更多高质量数据。目前已有多种计算算法可帮助从复杂数据集中提取这些多构象信息，我们建议读者参考Scheres的“Processing of Structurally Heterogeneous Cryo-EM Data in RELION” 、Grigorieff的““FREALIGN: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM“和Ludtke的“Single Particle Refinement and Variability Analysis in EMAN2.1“等专题以获取更详细技术指导。
在特定研究中，可通过添加配体（如小分子化合物、蛋白质结合伙伴和核苷酸等）来稳定特定构象，或探究配体如何影响复合物构象平衡状态的特定生物学机制。这些研究通常需要收集额外的大型数据集，以便在小型数据集确认构象变化或验证目标配体结合后，进一步达到高分辨率结构解析。
最后，也是最为重要的一点，所有高分辨率数据集的收集过程都应充分考虑结构验证策略（参见Rosenthal的“Testing the Validity of Single Particle Maps at Low and High Resolution”）。具体而言，我们强烈建议对每个用于确定先前未知结构的数据集收集一定比例的倾斜对照图像（约占总显微照片数量的1-2%）。这些倾斜对照随后可用于验证重构密度图的准确性，测量投影分配的角度精度，并确定结构的绝对手性。
通过采用上述系统化的方法论，研究人员将有最佳机会高效地从溶液状态的蛋白质样品中获得高分辨率三维结构。
参考资料 SpecimenPreparationforHigh-ResolutionCryo-EML.A.Passmore1,C.J.Russo1
