来源：Mowery, Joseph & Bauchan, Gary. (2018). Optimization of Rapid Microwave Processing of Botanical Samples for Transmission Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24. 1202-1203. 10.1017/S1431927618006499.
▍前言
传统的TEM样品制备，尤其是对于结构复杂的植物样品，其漫长的处理周期（通常需要3-4天）一直是制约研究效率的瓶颈。试剂缓慢的渗透扩散速率，常常让研究人员在等待中消耗宝贵的时间。
今天，为大家介绍一项由美国农业部农业研究局（USDA-ARS）电子与共聚焦显微镜部门的 Joseph Mowery 和 Gary Bauchan 研究员带来的优化技术，该技术利用快速微波处理，可以优化植物样品TEM制备的流程。
▍微波技术：加速渗透的利器
微波（MW）辐射技术并非全新概念，它通过加速试剂分子运动，极大地提高了试剂向组织内部的扩散速率，有望将整个制备流程从数天缩短至几小时内。然而，随着现代微波处理系统（如本研究使用的 Pelco BioWave Pro+）的不断进步，针对特定样品类型（尤其是植物样品）优化处理方案显得尤为重要和迫切。植物样品因其独特的结构，往往需要额外的处理步骤，这也正是本研究的焦点所在。
▍挑战与优化：攻克植物样品的特殊难题
研究团队以烟草（Nicotiana tabacum）和番茄（Solanum lycopersicum）的叶片组织为模型，进行了一系列细致的优化工作。
▶ 样品均一性与渗透效率：
• 关键： 微波处理中，样品尺寸和一致性至关重要。
• 优化： 使用1毫米打孔器取样，确保大小一致。
▶ 克服“漂浮”难题：
• 挑战： 植物叶片含气易漂浮，影响渗透。
• 优化：
– 真空/常压循环去空气。
– 加0.2% Tween-20助沉降。
▶ 解决树脂粘附难题：
• 挑战： 蜡质角质层致树脂粘附不良。
•优化：脱水时加Z-6040硅烷偶联剂增粘附。
▶ 树脂渗透与聚合：
• 流程： 梯度脱水、过渡、树脂渗透。
• 优化： 采用两步法水下微波聚合。
▍优化后的详细流程
| 步骤 | 时间 | 功率(W) | 真空 | 温度(°C) |
|---|---|---|---|---|
| 固定液 / 真空 (x5-10) | 2分真空, 2分放气 (x5-10) | 0 | 开 | 60 |
| 初级固定 | 2分开, 2分关, 2分开 | 150 | 循环¹ | 60 |
| 初级固定 (强化) | 10秒开, 20秒关, 10秒开 | 650 | 开 | 60 |
| 缓冲液漂洗 | 1 分钟 | 150 | 循环 | 60 |
| 1% OsO₄ 后固定 | 5开, 2关, 5开, 2关, 5开 | 200 | 循环 | 60 |
| 缓冲液漂洗 | 1 分钟 | 150 | 循环 | 60 |
| 4% 醋酸铀染色 | 2分开, 2分关, 2分开 | 150 | 循环 | 60 |
| 25% EtOH, 1% Z-6040 | 5 分钟 | 250 | 循环 | 60 |
| 50% EtOH, 1% Z-6040 | 5 分钟 | 250 | 循环 | 60 |
| 75% EtOH, 1% Z-6040 | 5 分钟 | 250 | 循环 | 60 |
| 85% EtOH, 1% Z-6040 | 5 分钟 | 250 | 循环 | 60 |
| 95% EtOH | 5 分钟 | 250 | 循环 | 60 |
| 100% EtOH (x3) | 5 分钟 (x3) | 250 | 循环 | 60 |
| 100% PO (x2) | 5 分钟 (x2) | 250 | 关 | 60 |
| 25% LX-112 Resin | 20 分钟 | 250 | 循环 | 60 |
| 50% LX-112 Resin | 20 分钟 | 250 | 循环 | 60 |
| 75% LX-112 Resin | 20 分钟 | 250 | 开 | 60 |
| 100% LX-112 Resin (x4) | 20 分钟 (x4) | 250 | 开 | 60 |
| 聚合 Step 1 | 30 分钟 | 250 | 关 | 60 |
| 聚合 Step 2 | 90 分钟 | 450 | 关 | 100 |
*注：真空循环指在20英寸汞柱下每30秒开关一次真空。聚合步骤在密封的Beem胶囊中水下进行。EtOH=乙醇, PO=环氧丙烷。
▍结果与意义：更快、更好
通过应用这一系列优化措施，研究团队不仅显著缩短了样品处理时间，更重要的是：
- •超微结构保存改善： 与传统方法比有轻微改善。
- •微波聚合优势： 形态保存有优势。
(图1：微波处理样品超微结构。)
PELCO BioWave Pro+ 微波快速组织处理仪介绍
